斯氏副柔線蟲CAMK/TSSK蛋白激酶基因的克隆及其蛋白質結構與抗原表位預測分析

王文龍，趙學亮，孫　柯，馮陳晨，白麗艷，王姝懿,3，王夢雅，劉春霞

(1. 內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，呼和浩特 010018；2. 內蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018；3. 內蒙古自治區(qū)綜合疾病預防控制中心，呼和浩特 010018; 4. 內蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，呼和浩特010018)

駱駝斯氏副柔線蟲(Parabronemaskrjabini)屬于旋尾目，副柔屬[1-2]，是一種寄生在駱駝、牛、羊等反芻動物真胃引起疾病的寄生蟲，其中駱駝是其最適宜的終末宿主[3-4]。當駱駝大量感染斯氏副柔線蟲時會導致腹瀉、生長遲緩，真胃黏膜潰瘍、出血，淋巴細胞浸潤等現(xiàn)象，嚴重者會導致貧血死亡。國內自楊曉野[5]最早發(fā)現(xiàn)斯氏副柔線蟲病以來，經(jīng)流行病學調查發(fā)現(xiàn)斯氏副柔線蟲已廣泛存在，并且在不同地區(qū)的感染率為72%～100%。據(jù)報道，內蒙古地區(qū)雙峰駝斯氏副柔線蟲感染率高達100%，感染強度最高可達7 611條[6]。目前，斯氏副柔線蟲病仍然嚴重危害我國牧區(qū)駱駝的健康，制約著當?shù)仞B(yǎng)駝業(yè)的發(fā)展，給農(nóng)牧民造成巨大的經(jīng)濟損失。

由于駱駝主要分布在經(jīng)濟欠發(fā)達國家或地區(qū)，導致斯氏副柔線蟲病的相關研究資料較少，尤其是駱駝斯氏副柔線蟲病致病作用的資料極度缺乏。目前，國內外對于駱駝斯氏副柔線蟲病的研究主要在于形態(tài)學鑒定、流行病學調查等方面[7]，尚無有效疫苗用于該病的預防，也未見報道該病有效的生前診斷方法。目前，在生產(chǎn)實踐中，往往是在沒有診斷依據(jù)的情況下盲目給藥驅蟲，不僅造成經(jīng)濟損失，而且也會導致藥物殘留超標和耐藥蟲株的產(chǎn)生。因此，對該病的研究應致力于在探索斯氏副柔線蟲病生物學特征的基礎上，尋找有效的生前診斷方法和制定新的防治措施。

本試驗選取駱駝斯氏副柔線蟲為研究對象，參考已報道的線蟲免疫學診斷抗原的特點，在斯氏副柔線蟲轉錄組測序分析的基礎上[8-9]，篩選出與斯氏副柔線蟲免疫相關的基因，通過Blastx比對確定駱駝斯氏副柔線蟲免疫相關基因CTPK(CAMK/TSSK protein kinase)。通過克隆斯氏副柔線蟲CTPK基因的CDS區(qū)，利用生物信息學方法對該基因結構、理化性質及抗原表位等進行分析和預測，以期找到優(yōu)勢抗原表位，為駱駝斯氏副柔線蟲病生前診斷方法iELISA的建立和DNA疫苗的研究奠定了理論基礎。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1蟲體和質粒駱駝斯氏副柔線蟲樣本采自于巴彥淖爾市烏拉特后旗雙峰駝真胃。在體視鏡下根據(jù)蟲體不同形態(tài)特征鑒定雌雄后分裝到2 mL凍存管中，標記后放入液氮中由本實驗室保存，用于RNA的提取。

試驗所用菌株：E.coliDH5α，北京全式金(TransGen Biotech)生物技術有限公司；質粒載體：克隆載體pMD19-T simple vector，大連寶生物工程有限公司。

1.1.2主要試劑與儀器Trizol 通用型RNA快速提取試劑盒、高保真酶Prime STAR?GXL DNA Polymerase、標準相對分子質量DNA Marker購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自AXYGEN公司，DEPC處理水。NanoDROP核酸濃度測定儀，ND2000美國Thermo公司；凝膠影像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司等。

1.2　CTPK的擴增

1.2.1總RNA提取與反轉錄按照Trizol[10]抽提總RNA說明書，提取斯氏副柔線蟲總RNA。將獲得的總RNA進行濃度、純度檢測后，利用反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.2.2目的基因的擴增CTPK序列來自本實驗室駱駝斯氏副柔線蟲高通量轉錄組測序序列，應用Primer5.0和Oligo6.24軟件設計引物，同時在引物序列中加入酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ，并由華大基因有限公司合成，預期擴增的DNA片段約為519 bp。引物序列，上游引物：5′-GCAGAATTCATGTCCACAAAGACCAC-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點)；下游引物：5′-CCACTCGAGACCGTTTTGTTGCACG-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。以合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系50 μL：cDNA 4 μL；Up-Primer 1 μL；Down-Primer 1 μL；Prime Star GXL DNA Polymerase 2 μL；5×Prime Star GXL Buffer(Mg2+plus) 10 μL；dNTP Mixture 4 μL；ddH2O 補齊至 50 μL。PCR擴增條件： 95 ℃預變性5 min； 94 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min，共31個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3　CTPK基因的克隆和測序

將PCR產(chǎn)物目的片段按照Axygen DNA膠回收試劑盒說明書進行膠回收，利用寶生物公司的DNA A-Tailing Kit對CTPK基因PCR產(chǎn)物進行平末端DNA片段的3′末端加一個“A-尾”，從而提高了平末端DNA片段的TA克隆效率。具體步驟：10×A-Tailing Buffer 5 μL；dNTP Mixture 4 μL；A-Tailing Enzyme 0.5 μL；平末端DNA片段0.5～5 μg；補ddH2O至50 μL；緩慢混勻后，72 ℃反應20 min；在冰浴中靜置2 min。然后按照pMD19-T說明書，將加尾后的PCR產(chǎn)物與克隆載體 pMD19-T 16 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉化至Trans1-T1感受態(tài)細胞中：將100 μL 感受態(tài)細胞放入冰盒中融化，加入過夜連接產(chǎn)物10 μL，混勻后冰浴30 min，42 ℃水浴45 s，冰浴2 min，然后加入無抗性LB培養(yǎng)液500 μL，37 ℃ 190 r·min-1搖菌2～3 h，最后取100 μL涂布在氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落放入含有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌一段時間后，觀察菌液渾濁程度，如有渾濁可進行菌液PCR鑒定，陽性菌株送華大基因公司進行雙向序列測定。將測序結果正確的質粒命名為pMD19T-CTPK。

1.4　CTPK基因生物信息學分析

使用DNAStar中的EditSeq推導斯氏副柔線蟲CTPK基因的氨基酸序列，然后利用Prot-Param在線軟件分析CTPK蛋白的氨基酸序列組成和理化性質；利用ProtScale軟件分析氨基酸殘基的親疏水性；利用TMHMM Server和SignaIP 4.1 Server[11]分析工具預測該蛋白質的跨膜區(qū)及信號肽；利用SOPMA在線軟件分析蛋白質的二級結構；根據(jù)在線軟件Phyre2.0[12]預測CTPK蛋白的三級結構；應用NetPhos3.0 Server軟件預測磷酸化位點；運用SecretomeP軟件預測非典型分泌蛋白；利用DNAStar分析CTPK蛋白質表面可行性，B細胞、T細胞抗原表位等[13]。

2　結　果

2.1　目的基因的PCR擴增

以cDNA為模板擴增CTPK基因，目的片段為519 bp，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果與預期目的基因片段大小一致(圖1)。

M. DNA相對分子質量標準DL2000；1～4. CTPK基因擴增產(chǎn)物M. DNA marker DL2000;1-4. Products of CTPK gene圖1　CTPK基因PCR擴增結果Fig.1　PCR amplification of CTPK gene

2.2　CTPK基因的生物信息學分析

2.2.1CTPK基因序列分析與測定利用NCBI中的ORF Finder工具，對CTPK基因cDNA全長序列進行分析，結果表明，該基因cDNA序列全長共519 bp，含有一個編碼173個氨基酸的完整ORF。重組基因測序后序列與轉錄組測序序列相似性為98.46%，發(fā)現(xiàn)8個突變位點：C139T、G165A、C189T、G199A、A213G、G321A、A348T、G408A。利用在線軟件Rare Codon Caltor對斯氏副柔線蟲重組基因測序序列和轉錄組序列進行稀有密碼子分析，發(fā)現(xiàn)是同義突變，且突變前后稀有密碼子種類、數(shù)量沒有改變。

2.2.2CTPK蛋白理化性質分析使用Port-Param在線軟件分析CTPK蛋白的理化性質，結果表明CTPK蛋白相對分子質量為20.264 ku，理論等電點(theoretical PI)為9.53，原子總數(shù)共2 831個，分子式(Formula)為C895H1403N263O264S6，包含20種氨基酸，其中含量最高的是Lys(占8.7%)，含量最低的是Trp占0.6%；帶正電荷數(shù)(Arg+Lys)為27個，帶負電荷數(shù)(Asp+Glu)為16個；蛋白質不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)為53.22，說明該蛋白質是不穩(wěn)定蛋白(注：不穩(wěn)定系數(shù)小于40，說明是穩(wěn)定蛋白，反之則是不穩(wěn)定蛋白)；脂肪系數(shù)(Aliphatic index)為64.74；總平均親水指數(shù)(Grand average of hydropathicity)為-0.925，說明該蛋白質是親水性蛋白；假定所有的半胱氨酸都形成二硫鍵，CTPK在280 nm處的摩爾消光系數(shù)為23 630 (mol·cm)，在0.1%(=1 g·L-1)溶液中的摩爾消光系數(shù)為1.154；而當所有的二硫鍵打開時280 nm處摩爾消光系數(shù)為23 380 (mol·cm)，在0.1%(=1 g·L-1)溶液中摩爾消光系數(shù)1.517。當成熟肽N端的1個氨基酸為Met時，CTPK蛋白在體外哺乳動物網(wǎng)狀紅細胞中的半衰期為30 h，在酵母體內的半衰期大于20 h，在大腸埃希菌體內的半衰期大于10 h。

2.2.3CTPK蛋白疏水性/親水性預測分析氨基酸殘基根據(jù)其親疏水性可分為親水性氨基酸和疏水性氨基酸。親水性氨基酸位于蛋白質的表面，連續(xù)在一起形成抗原表位，同時也是判斷B細胞抗原表位的主要參數(shù)[14]。而疏水性氨基酸位于蛋白內部。應用ProtScale在線軟件對斯氏副柔線蟲CTPK基因編碼蛋白親水性/疏水性進行分析(圖2)。由輸出的文本可知其疏水性在143～144位點有最大值2.222，在27位點有最小值-3.267。根據(jù)氨基酸分值越高疏水性越強或氨基酸分值越低親水性越強的規(guī)律分析得出，CTPK基因編碼蛋白多肽鏈大部分區(qū)域分值為負值，說明該蛋白質是親水性蛋白，與Port-Param預測結果相一致。

2.2.4CTPK蛋白跨膜區(qū)和信號肽預測膜蛋白是鑲嵌在生物膜中的蛋白質，在細胞中起著至關重要的作用，它們構成了各種激素、受體和神經(jīng)信號，同時也是離子跨膜的通道。應用TMHMM預測CTPK蛋白無跨膜區(qū)，不是跨膜蛋白，且整個蛋白全部位于膜外(圖3)，跨膜區(qū)中的氨基酸期望值約為0.176(該數(shù)值大于18時表明有跨膜區(qū))。

圖2　CTPK蛋白疏水性預測Fig.2　Prediction of hydrophobicity of CTPK protein

信號肽是由蛋白質N端15～30個氨基酸殘基組成的一段疏水肽段，決定蛋白質在細胞中的最終定位。信號肽不但決定蛋白質是否為分泌蛋白，而且與新生肽鏈在細胞內全方位定位有關。應用在線軟件SignalP對CTPK蛋白的信號肽進行預測，綜合圖形和輸出文本分析發(fā)現(xiàn)CTPK不存在信號肽(圖4)，但是在運用SecretomeP軟件預測非典型分泌蛋白發(fā)現(xiàn)，NN-Score=0.912(若NN-Score>0.5，判定為非典型分泌蛋白)，所以該蛋白質屬于分泌蛋白。

圖3　CTPK 蛋白跨膜結構預測Fig.3　Prediction of CTPK protein transmembarne domain

圖4　CTPK 蛋白信號肽序列預測Fig.4　Prediction of signal peptide sequence of CTPK protein

2.2.5CTPK蛋白磷酸化位點的預測磷酸化是最重要的蛋白質翻譯后修飾之一，與蛋白質的功能密切相關，蛋白質的磷酸化與去磷酸化為真核細胞提供了調節(jié)機制。隨著生物信息學的發(fā)展，對磷酸化位點的預測和發(fā)現(xiàn)已成為生物信息學焦點問題之一。通過在線軟件NetPhos2.0 Server預測CTPK蛋白磷酸化位點發(fā)現(xiàn)(圖5)，當潛在磷酸化位點的閾值為0.5時，CTPK蛋白存在24個潛在的磷酸化位點，其中包括10個絲氨酸位點，11個蘇氨酸位點，3個酪氨酸位點。

圖5　CTPK蛋白磷酸化位點預測Fig.5　Prediction of CTPK protein phosphorylation sites

2.2.6CTPK蛋白二級結構預測通過在線軟件SOPMA對斯氏副柔線蟲CTPK基因編碼蛋白的二級結構進行預測，可見CTPK蛋白中參與α螺旋形成的氨基酸有34個，占19.65%；參與β轉角形成的氨基酸有25個，占14.45%；參與延伸鏈形成的氨基酸有32個，占18.50%；參與無規(guī)則卷曲形成的氨基酸為82個，占47.40%。

2.2.7CTPK蛋白三級結構預測應用在線軟件 Phyre2.0 對CTPK蛋白的三級結構預測，結果表明：CTPK蛋白由α螺旋、β轉角、延伸鏈和無規(guī)卷曲組合形成超二級結構，經(jīng)折疊、彎曲等一系列復雜的過程形成了CTPK蛋白的三級結構(圖6)。

圖6　CTPK三級結構的預測Fig.6　Prediction of tertiary structure of CTPK

2.2.8CTPK蛋白抗原表位的分析利用DNAStar軟件對CTPK蛋白抗原表位進行分析，由圖7可知其親水性位點主要在1—69、72—74、78—81、84—95、99—103、113—138、158—162、170—173位氨基酸處，與之前ProtScale預測的結果相符。根據(jù)Plot-Emini方法預測其表面可行性(圖8)，在1—16、19—33、36—60、67—68、82—85、89—91、101—104、111—121、128—137、159—162、171—173位的氨基酸處有較高的可行性。根據(jù)Jameson-Wolf 方法預測CTPK蛋白的抗原性系數(shù)，該蛋白質含有較多潛在的B細胞抗原表位(圖9)，主要位于1—63、67—73、82—96、98—99、101—107、111—126、133—140、148—151、158—164、171—173位氨基酸殘基或其附近，提示這些區(qū)段含有潛在優(yōu)勢抗原表位。然后再結合蛋白質二級結構、親疏水性和表面可能性，綜合分析CTPK蛋白潛在的蛋白抗原表位，在1—60、82—95、111—126、133—137、158—162、171—173等位氨基酸殘基區(qū)域β轉角和無規(guī)則卷曲結構較多、親水性和表面可能性指數(shù)較高，暴露于表面的概率較大，提示作為B細胞抗原表位的可能性較大。T細胞表位是可以被TCR識別的抗原表位。應用Rothbard-Tayloy方法預測含有特定基序(motif)的潛在T淋巴細胞抗原表位，利用AMPHI方法預測免疫優(yōu)勢輔助性T淋巴細胞抗原位點，綜合兩種方法預測T細胞抗原表位(圖10)，CTPK蛋白的T細胞抗原表位可能有9個，主要位于4—10、42—52、75—77、90—98、105—113、115—118、123—128、130—140、158—161位氨基酸殘基或其附近，且分布較均勻。

3　討　論

近年來，斯氏副柔線蟲病在駱駝養(yǎng)殖中仍處于較高的感染水平，由于駱駝主要分布在經(jīng)濟欠發(fā)達國家或地區(qū)，導致斯氏副柔線蟲病的相關研究資料較少，到目前為止，其確切的生活史仍未完全研究清楚。在斯氏副柔線蟲病的防治上，尚缺乏有效的生前診斷方法和防治新措施。本研究通過克隆CTPK的編碼區(qū)序列，利用生物信息學技術對分泌蛋白CTPK進行分析，采用不同方法和多種參數(shù)聯(lián)合預測，以提高預測的準確性，為駱駝斯氏副柔線蟲病的生前診斷建立和疫苗研制提供參考。

生物信息學是近年來發(fā)展起來的一種高效的研究手段，促進了生物學研究領域的快速發(fā)展[15]，在寄生蟲的研究上，也得到了廣泛應用[16]。生物信息學技術已被廣泛應用于預測和篩選有效的疫苗候選基因[17]。寄生蟲的一些分泌性蛋白是蟲體的表皮、腸上皮或分泌排泄器官不斷分泌的抗原物質。這些抗原暴露于宿主免疫系統(tǒng)，是刺激宿主產(chǎn)生特異性免疫應答的重要靶抗原，被認為是與寄生蟲免疫相關的抗原蛋白，在寄生蟲建立寄生生活，免疫調節(jié)和免疫逃避中起關鍵作用[18-19]。這些功能性抗原可以為篩選疫苗抗原、發(fā)掘藥物靶點和確定診斷抗原提供依據(jù)[20-21]。

圖7　CTPK蛋白親水性預測Fig.7　Prediction of hydrophilicity of CTPK protein

圖8　CTPK蛋白表面可及性預測結果Fig.8　Prediction of surface probability of CTPK protein

圖9　CTPK蛋白B細胞抗原表位預測結果Fig.9　Prediction of B-cell antigenic epitopes of CTPK protein

圖10　CTPK蛋白T細胞抗原表位預測結果Fig.10　Prediction for T-cell antigenic epitopes of CTPK protein

本試驗克隆了CTPK的編碼區(qū)序列，采用生物信息學方法對分泌蛋白CTPK的理化性質、二級結構、B/T細胞抗原表位進行預測分析，結果表明：蛋白質理論相對分子質量為20.264 ku，理論等電點為9.53，在組成CTPK蛋白的20種氨基酸中，含量最高的是Lys占8.7%，含量最低的是Trp占0.6%；蛋白質不穩(wěn)定指數(shù)為53.22，說明該蛋白質是不穩(wěn)定蛋白；總平均親水指數(shù)為-0.925，說明該蛋白質是親水性蛋白，親水區(qū)的存在有利于蛋白的高效表達；CTPK蛋白是一種不具有信號肽序列的非典型分泌蛋白(NN-Score=0.912)，蛋白跨膜區(qū)預測分析表明該蛋白質不是跨膜蛋白，主要位于胞外區(qū)。利用DNAStar對斯氏副柔線蟲CTPK蛋白的T/B細胞抗原表位進行預測，從該蛋白質的親水性與表面可行性等方面分析，該蛋白質親水性多肽較多，其合成的多肽很可能易溶于水；表面可行性較高區(qū)域可能位于CTPK蛋白分子表面。綜合分析發(fā)現(xiàn)在1—60、82—95、111—126、133—137、158—162、171—173位氨基酸殘基存在潛在的B細胞抗原表位；在4—10、42—52、75—77、90—98、105—113、115—118、123—128、130—140、158—161位氨基酸殘基存在潛在的T細胞抗原表位，具有較好的抗原性，符合寄生蟲免疫學診斷和免疫防治候選基因的特點。本試驗為駱駝斯氏副柔線蟲病早期快速診斷試劑盒的建立奠定基礎，同時也為其DNA疫苗的研制提供理論依據(jù)。

4　結　論

擴增斯氏副柔線蟲免疫相關基因CTPK的CDS區(qū)，其cDNA序列全長共519 bp，編碼173個氨基酸，推導CTPK的相對分子質量為20.26 ku，理論等電點為9.53。結構分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質無跨膜區(qū)，無規(guī)則卷曲構成二級結構的主要組分，親水性氨基酸比例超過60%；抗原表位預測表明，CTPK蛋白是一種抗原性較高的親水性蛋白。推測CTPK有望用作斯氏副柔線蟲的免疫診斷抗原和疫苗候選抗原。

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