河北省豬腹瀉相關(guān)病毒的檢測(cè)及豬流行性腹瀉病毒S基因遺傳變異分析

張若曦，張　志，顧文源，劉天駒，李　翀，王建昌，李　彬，袁萬(wàn)哲，王玉清，韓慶安*

(1.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，石家莊 050035； 2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032；3.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，石家莊 050051； 4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，南京 210014；5.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071001)

豬病毒性腹瀉是豬場(chǎng)常見(jiàn)疾病之一，主要病原是豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritisvirus, TGEV)和豬輪狀病毒(porcine rotavirus, PoRV)。這三種腹瀉病毒以單獨(dú)或混合感染方式引起豬群嘔吐、水樣腹瀉、脫水、逐漸消瘦等臨床癥狀，對(duì)仔豬危害較大，可導(dǎo)致仔豬高死亡率，造成養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。自2010年以來(lái)，我國(guó)多省大范圍暴發(fā)以嚴(yán)重腹瀉和仔豬高死亡率為癥狀的豬腹瀉病，在2011年和2012年最為嚴(yán)重，PEDV變異株的流行是導(dǎo)致此次疫情暴發(fā)的主要原因[3-4]。在河北地區(qū)，2010年開(kāi)始暴發(fā)腹瀉疫情，腹瀉病高發(fā)時(shí)期在2011 年至 2012 年間，與其他省份的報(bào)道基本一致，而在2013年河北省腹瀉病發(fā)生率明顯回落[5-7]。2013年后，河北省鄰近地區(qū)腹瀉病發(fā)生情況略有不同，山東省部分地區(qū)腹瀉病呈現(xiàn)緩和態(tài)勢(shì)[8-9]，而在山西、遼寧等地腹瀉病仍呈現(xiàn)高發(fā)生率和高死亡率[10-11]。為摸清當(dāng)前河北地區(qū)豬病毒性腹瀉的流行狀況和遺傳變異規(guī)律，2016年4月至2017年2月，本研究采集河北省11個(gè)地市無(wú)害化處理廠、門(mén)診部和屠宰場(chǎng)發(fā)病豬樣品，進(jìn)行PEDV、TGEV和PRoV的流行病學(xué)調(diào)查和PEDVS基因的遺傳變異分析，為河北省豬病毒性腹瀉的綜合防控提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　流行病學(xué)調(diào)查和樣品采集

2016年4月至2017年2月期間，通過(guò)對(duì)河北省11個(gè)地市的無(wú)害化處理廠和門(mén)診部送檢的1 855例患豬病例進(jìn)行背景分析，腹瀉發(fā)病豬180例。對(duì)腹瀉發(fā)病豬采集小腸組織或小腸內(nèi)容物用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2　主要試劑與設(shè)備

TaqDNA聚合酶、dNTPs購(gòu)自上海生工科技有限公司；磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；豬傳染性胃腸炎病毒/流行性腹瀉病毒/輪狀病毒三重核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

組織研磨儀購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；核酸提取儀購(gòu)自賽默飛世爾生物科技公司；四通道熒光PCR儀購(gòu)自西安天隆科技有限公司。

1.3　樣品處理和檢測(cè)方法

取腹瀉病料小腸組織樣品或腸內(nèi)容物加1 mL PBS制成組織勻漿，反復(fù)凍融3次；5 000 r·min-1離心5 min，取200 μL上清液進(jìn)行核酸提取。按熒光PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系并加入模板，利用熒光PCR儀，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定擴(kuò)增程序進(jìn)行熒光RT-PCR，待擴(kuò)增結(jié)束后按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4　PEDV S基因引物的設(shè)計(jì)與目的片段擴(kuò)增

以PEDV流行株AJ1102株為參考模板，利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)三對(duì)用于擴(kuò)增PEDVS基因的引物(表1)，利用RT-PCR對(duì)9份來(lái)源不同的PEDV陽(yáng)性病料擴(kuò)增S基因，經(jīng)測(cè)序拼接后獲得完整的S基因序列。

1.5　PCR產(chǎn)物回收與測(cè)序

PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；將膠回收產(chǎn)物送上海生工科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6　測(cè)序結(jié)果分析

通過(guò)BioEdit將所克隆獲得的S基因與GenBank上發(fā)表的33條國(guó)內(nèi)外PEDVS基因推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析(表2)。利用MEGA 7.0程序軟件的鄰位相接法(Neighbor-joining 法)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，并以Bootstrap 值驗(yàn)證進(jìn)化樹(shù)的可信度。利用NetNGlyc 1.0 Server對(duì)S蛋白糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表1PEDVS全長(zhǎng)基因擴(kuò)增序列

Table1TheprimersusedforamplificationofPEDVSgene

名稱Primer引物序列(5'-3')Sequence退火溫度/℃Temperature片段起止位置Position擴(kuò)增長(zhǎng)度/bpFragmentS-F1S-R1AAGTGGCGCTGTGATTGACAGAAAGAACTAAACCCATTGATA575520376—20393bp22238—22261bp1885S-F2S-R2TTCTTGGCTGTTTTACCTCCTACCCTTCTCGGCGTCAACAACACC606221792—21815bp23360—23480bp1688S-F3S-R3AATGGCCTTGGTACTGTTGATGAACGTGTATTGAAAAAGTCCGAGAAA605823355—23378bp24794—24817bp1462

表2PEDV參考毒株信息

Table2RepresentativePEDVstrainsusedinthisstudy

毒株Strain分離地Collectedarea登錄號(hào)AccessionNo.毒株Strain分離地Collectedarea登錄號(hào)AccessionNo.AH2012ChinaKC210145SHQP-YM-2013ChinaKJ196348AH2012-12ChinaKU646831SLO-JH-11-2015SloveniaKU297956AJ1102ChinaJX188454SM98SouthKoreaGU937797Attenuated_DR13SouthKoreaJQ023162Tottori2-JPN-2014JapanLC022792CH-AHHF-2-2012ChinaJX018182USA-IL20697-2014USAKT860508CHGD-01ChinaJX261936USA-Iowa106-2013USAKJ645695CH-HNAY-2015ChinaKR809885USA-Iowa107-2013USAKJ645696CH-JX-1-2013ChinaKF760557USA-Iowa303-2014USAKR265827CV777BelgiumAF353511USA-KS-2013USAKJ184549FL2013ChinaKP765609USA-Michigan252-2014USAKR265822GD-AChinaJX112709USA-Minnesota52-2013USAKJ645704JS2008ChinaKC109141USA-Minnesota61-2013USAKJ645705JS-HZ2012ChinaKC210147USA-Ohio126-2014USAKJ645702MF3809SouthKoreaKF779469USA-Texas435-2014USAKR265834OH851USAKJ399978VirulentDR13SouthKoreaDQ862099PC21AUSAKR078299YC2014ChinaKU252649PEDV-LYGChinaKM609212

2　結(jié)　果

2.1　病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查

對(duì)全年送檢的1 855例患豬病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中腹瀉病例共180例，占全年總送檢病例的9.70%。對(duì)腹瀉病樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)25份病料有PEDV檢出，檢出率為13.89%；9份病料有PoRV檢出，檢出率為5.00%；TGEV僅在3份病料中檢出，檢出率為1.67%(表3)。對(duì)河北地區(qū)11地市檢出結(jié)果進(jìn)行分別統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，各地市PEDV和TGEV檢出情況與河北省基本一致，但少數(shù)地市PoRV的檢出率偏高(圖1)。綜合以上結(jié)果表明，當(dāng)前PEDV仍是引起河北地區(qū)豬群腹瀉病的主要病毒性病原。

對(duì)腹瀉病樣品按豬年齡分類(lèi)進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，PEDV在仔豬和育肥豬中均有較高檢出率，在仔豬中檢出率最高，可達(dá)19.28%；TGEV和PoRV則在育肥豬中檢出率最高，分別達(dá)6.90%和13.79%(表3)。

圖1　河北省11地市腹瀉相關(guān)病原調(diào)查結(jié)果Fig.1　Investigation of diarrhea related pathogen from Hebei province

對(duì)腹瀉病樣品按采樣點(diǎn)來(lái)源進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，PEDV在無(wú)害化處理廠檢出率高達(dá)30.00%，而TGEV和PoRV沒(méi)有檢出；另外，PEDV和PoRV在門(mén)診部均有一定檢出，檢出率分別為17.60%和6.40%，TGEV檢出率僅為1.60%(表3)。

在全年所檢樣品中，PEDV和TGEV發(fā)生率均在寒冷的冬春季節(jié)最高，在盛夏季節(jié)發(fā)生率最低；而PoRV發(fā)生率在春夏、夏秋季節(jié)變換時(shí)最高，在盛夏和深冬發(fā)生率較低(圖2)，表明在河北地區(qū)，春冬季節(jié)仍是病毒性腹瀉病原多發(fā)季節(jié)，而夏季較少發(fā)生。

在檢出腹瀉相關(guān)病原的樣品中，PEDV單獨(dú)感染率最高，達(dá)54.70%，PoRV單獨(dú)感染率為22.11%，TGEV單獨(dú)感染率為10.54%。在所檢測(cè)具有腹瀉相關(guān)病原的樣品中，PEDV和TGEV共感染率為5.91%，PEDV和PoRV共感染率為6.17%，TGEV和PoRV共感染較少發(fā)生，共感染率僅為0.51%(圖3)。所檢樣品中未發(fā)現(xiàn)3種腹瀉相關(guān)病原共感染情況。以上結(jié)果表明，PEDV引起的腹瀉疾病主要以單獨(dú)感染為主。

表3河北地區(qū)腹瀉相關(guān)病毒檢測(cè)情況

Table3ThepositiverateofPEDV,TGEVandPoRV

檢測(cè)病原Detectedpathogen總體檢出率/%(檢出數(shù))Totaldetectionrate(number)不同類(lèi)型豬群檢出率/%Detectionrateofdifferenttypesofpigs不同采樣點(diǎn)檢出率/%Detectionrateofdifferentsamplingpoints仔豬Piglet保育豬Nurserypig育肥豬Fatteningpig無(wú)害化處理廠Innocuoustreatmentplant門(mén)診部ClinicPEDV13.89(25)19.282.7817.2430.0017.60TGEV1.67(3)0.000.006.900.001.60PoRV5.00(9)3.612.7813.790.006.40

圖2　不同月份腹瀉相關(guān)病原調(diào)查結(jié)果Fig.2　Investigation of diarrhea related pathogen collected from different months

圖3　腹瀉相關(guān)病原混合感染情況Fig.3　Investigation of diarrhea related pathogen of single infection and co-infection

2.2　PEDV S基因序列分析

S蛋白被認(rèn)為是PEDV關(guān)鍵毒力蛋白，其遺傳變異往往造成毒株毒力改變[12-13]。本研究選取來(lái)源不同的9份PEDV病料對(duì)S基因進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序，得到9株P(guān)EDVS基因序列，并上傳至GenBank(登錄號(hào)：MG132631～MG132639)。經(jīng)相似性比較分析，發(fā)現(xiàn)本研究所獲得的9條S基因核苷酸序列相似性為96.8%～100.0%，推導(dǎo)氨基酸序列相似性為96.4%～100.0%。與GenBank上發(fā)表的33條國(guó)內(nèi)外PEDVS基因推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖4)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化樹(shù)主要分為G1、G2和INDELs三支，本研究所獲得的9條S基因全部位于G2上。G2這一大支又可以分為 G2a和G2b小支，本研究所獲得的9條S基因序列中，HB1601(MG132631)和HB1603(MG132632)株位于G2b分支，與美國(guó)流行毒株遺傳關(guān)系較近；HB16123(MG132637)、HB16134(MG132638)和HB16135(MG132639)株位于G2b分支，與中國(guó)流行毒株遺傳關(guān)系較近；HB1604(MG132633)和HB1605(MG132634)株以及HB1619(MG132635)和HB1622(MG132636)株位于G2a分支，與當(dāng)前國(guó)內(nèi)外流行毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4　河北地區(qū)PEDV毒株S基因氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.4　Phylogenetic analyses of PEDV strains based on the amino acid sequences of S gene

將所得到的S基因與PEDV變異毒株AH2012進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所測(cè)9條S基因氨基酸序列均有多處突變。其中，處于G2b分支上的毒株突變位點(diǎn)較多，達(dá)38～39個(gè)；處于G2a分支上的毒株與CV777相似突變位點(diǎn)較多，達(dá)14個(gè)(表4)。此外，HB1601和HB1603在382—383位氨基酸(TY)發(fā)生獨(dú)特缺失，HB1619和HB1622株在234—236位有三個(gè)獨(dú)特氨基酸插入(SAW)(表4)。經(jīng)NetNGlyc 1.0 Server軟件預(yù)測(cè)AH2012株S蛋白有67處潛在糖基化位點(diǎn)，其中29處為NXT/S糖基化位點(diǎn)。對(duì)所獲得的9條S基因氨基酸序列進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)多條S基因序列因氨基酸突變導(dǎo)致缺失或引入預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)，其中HB1601株缺失一處預(yù)測(cè)NXT/S糖基化位點(diǎn)，HB16123、HB16134和HB16135株增加兩處預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)，HB1604和HB1605株分別增加一處預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)(表4)。與33株參考序列相比，所獲得9條S基因氨基酸序列均發(fā)生多處獨(dú)特氨基酸突變，其中HB1601、HB1603、HB1605、HB16123、HB16134和HB16135株在S蛋白核心抗原展示區(qū)域均有獨(dú)特突變發(fā)生(表4)。

3　討　論

PEDV、TGEV 和PoRV是引起豬腹瀉病的主要病毒性病原，均以腹瀉癥狀為主要臨床特征，難以區(qū)分。河北地區(qū)自2010年開(kāi)始暴發(fā)豬群腹瀉病，在2011年和2012年疫情最為嚴(yán)重，2013年疫情趨于穩(wěn)定[7, 14]。本研究對(duì)2016年2月至2017年4月河北地區(qū)送檢臨床樣品進(jìn)行發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)和PEDV、TGEV 和PoRV病原學(xué)檢測(cè)。調(diào)查結(jié)果顯示，當(dāng)前河北省豬群腹瀉病發(fā)生率較2010—2013年有明顯緩解。不同于國(guó)內(nèi)南方地區(qū)全年腹瀉病均呈高發(fā)態(tài)勢(shì)[6, 15-18]，春冬季節(jié)為河北地區(qū)病毒性腹瀉病多發(fā)季節(jié)。通過(guò)對(duì)腹瀉病料調(diào)查，發(fā)現(xiàn)PEDV仍是腹瀉病的主要病毒性病原，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)少數(shù)地區(qū)正在流行PoRV，甚至個(gè)別地區(qū)PoRV是腹瀉病的主要病原，這提示PoRV在河北省大面積流行的風(fēng)險(xiǎn)正在提高。

2011—2015年間，全國(guó)各地PEDV流行毒株以引起仔豬高發(fā)病率和高死亡率為主要特征，在保育豬和育肥豬中檢出率較低[19-20]。本研究中，PEDV引起豬群腹瀉病以單獨(dú)感染為主，其在腹瀉病樣品中檢出率較之2010—2013年均顯著降低，但在育肥豬腹瀉病料中有較高的檢出率。母源抗體是保護(hù)豬群尤其仔豬抵抗PEDV感染的重要途徑，然而其抗體水平往往受病毒感染滴度影響[21-22]。本研究中，河北地區(qū)育肥豬的高感染率提示成年豬分泌抗體水平較之2010—2013年可能顯著提高，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)豬群免疫保護(hù)能力，降低河北省豬群整體PEDV感染率。

PEDV S 蛋白是病毒發(fā)生環(huán)境適應(yīng)的關(guān)鍵蛋白，其遺傳變異通常與病毒毒力相關(guān)，在分析流行毒株的流行趨勢(shì)和遺傳變異中具有重要的進(jìn)化意義[23]。2010年來(lái)，全國(guó)多地報(bào)道PEDV流行毒株S蛋白與經(jīng)典毒株變異較大，且分別進(jìn)化形成多種不同分支[24-27]。Y. Y. Gao等通過(guò)對(duì)S蛋白遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)2010年后華北豬場(chǎng)中流行的PEDV毒株與韓國(guó)來(lái)源毒株進(jìn)化關(guān)系較近[23]。本研究中，所獲得9條PEDV S蛋白氨基酸序列同源性為96.4%～100.0%。遺傳進(jìn)化分析表明，河北省PEDV S蛋白分處于G2亞群中的2個(gè)不同進(jìn)化分支，均與疫苗株CV777遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。其中HB1601和HB1603株與美國(guó)分離株親緣性較近，HB16123、HB16134和HB16135與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)分離株親緣性較近，HB1604、HB1605株和HB1619、HB1622株分處的G2a分支則與當(dāng)前國(guó)內(nèi)外流行毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，表明，河北地區(qū)流行的PEDV優(yōu)勢(shì)毒株可能發(fā)生了改變，多種毒株并存。

PEDV S蛋白是Ⅰ型糖蛋白，有27～30個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)往往與病毒毒力相關(guān)[13, 27]。其在S1區(qū)N端包含1個(gè)信號(hào)肽(l～18 aa)，在S1和S2膜外域編碼4個(gè)抗原表位(499—638、748—755、764—771和1 368—1 374 aa)，其中499—638 aa為誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的核心區(qū)域，亦稱為COE抗原區(qū)域[28-29]。T. Sato等將PEDV在細(xì)胞上連續(xù)傳代致弱，發(fā)現(xiàn)S蛋白信號(hào)肽、S1和S2膜外區(qū)的氨基酸突變是造成毒株毒力減弱的關(guān)鍵因素[30]。本研究對(duì)9株P(guān)EDV S蛋白氨基酸序列分析，結(jié)果顯示與國(guó)內(nèi)流行毒株AH2012相比，9株S蛋白氨基酸序列均發(fā)生多處突變，部分突變位點(diǎn)與CV777疫苗株相同。同時(shí)，與33株參考序列相比，9株S蛋白氨基酸序列在S蛋白膜外區(qū)均發(fā)生多處獨(dú)特性突變，表明PEDV S蛋白在河北地區(qū)的進(jìn)化方向具有多樣性，其是否影響S蛋白毒力和抗原性尚不得而知。其中，HB1601和HB1603在382—383 aa缺失兩位氨基酸(TY)，HB1619和HB1622在234—236 aa插入三位氨基酸突變位點(diǎn)(SAW)，這一插入缺失特征目前尚未有報(bào)道。通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，在HB1601、HB16123、HB16134、HB16135、HB1604和HB1605株中一些位點(diǎn)突變的發(fā)生可能會(huì)引起S蛋白糖基化位點(diǎn)失活或引入，推測(cè)這些位點(diǎn)突變有可能導(dǎo)致S蛋白毒力改變。此外，與33株參考序列相比，G2a分支和G2b分支S蛋白在COE區(qū)分別發(fā)生兩處和三處獨(dú)特性突變，這些突變可能會(huì)影響COE誘導(dǎo)中和抗體能力，改變毒株抗原性。綜上，河北地區(qū)PEDVS基因進(jìn)化分支較多，S蛋白的多種獨(dú)特突變可能導(dǎo)致PEDV流行毒株毒力和抗原性改變，這一推測(cè)有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4　結(jié)　論

2016年河北地區(qū)腹瀉發(fā)生率較以往有所下降，PEDV對(duì)仔豬的感染情況有所緩解，而對(duì)育肥豬感染率較高。PEDVS基因氨基酸序列分析表明，河北省PEDV流行毒株分布在G2群中的2個(gè)進(jìn)化分支，部分毒株發(fā)生獨(dú)特氨基酸突變。

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