miR?155在PM2.5染毒大鼠中的表達(dá)及意義

李男　王士娜　趙龍　毛明清　宋楠　李云霞　加慧　夏書月

沈陽醫(yī)學(xué)院12015級專業(yè)碩士研究生，32016級專業(yè)碩士研究生（沈陽 110034）；沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院2病理科，4呼吸科（沈陽 110024）

隨著空氣污染的日益加重，霧霾無疑已成為我國的一個(gè)棘手問題。霧霾的主要成分為大氣細(xì)顆粒（airborne fine particulate matter，PM2.5），為大氣總懸浮顆粒物中直徑≤2.5 μm的細(xì)顆粒物，其主要來源于工業(yè)燃料燃燒釋放、冬季采暖燃燒釋放、交通工具氣體排放、日常生活中的烹調(diào)及吸煙煙霧釋放，還包括自然災(zāi)害燃燒產(chǎn)物的釋放等［1］。細(xì)顆粒物主要成分為硫酸鹽、硝酸鹽、銨鹽、含碳顆粒、重金屬、礦物質(zhì)、細(xì)菌和病毒等［2］。由于呼吸系統(tǒng)與外界環(huán)境直接接觸，導(dǎo)致其是受PM2.5影響的最首要的部位。當(dāng)PM2.5與肺組織細(xì)胞接觸后，刺激肺巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)顆粒物，并可釋放多種細(xì)胞因子如IL?1β、IL-8、IL?6、腫瘤壞死因子（TNF）?α等誘發(fā)炎癥導(dǎo)致呼吸道局部免疫力下降［3］。研究表明，急性下呼吸道感染、慢性阻塞性肺疾病、肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病均與PM2.5暴露有關(guān)［4-6］，并可通過呼吸而沉積在肺泡中，甚至可以通過氣血屏障進(jìn)入血液循環(huán)而到達(dá)其他組織器官，引起多個(gè)系統(tǒng)損傷［7］。microRNAs是由基因組編碼的一組非編碼微小RNA分子，由18～22個(gè)核苷酸組成，其通過與相應(yīng)的靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（UTR）以堿基配對形式結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參加者多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程［8］。miR?155（microRNA?155）是miRNAs家族的重要成員之一，是由23個(gè)核苷酸組成的短鏈非編碼RNA。PM2.5可導(dǎo)致肺部的炎性損傷，而miR?155在炎癥應(yīng)答中起重要調(diào)控作用［9］。本實(shí)驗(yàn)通過PM2.5染毒大鼠，檢測miR?155的表達(dá)量，分析miR?155與炎性因子的相關(guān)性，進(jìn)而解釋miR?155在PM2.5染毒大鼠致炎損傷中的意義。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用12周清潔級健康雄性SD大鼠32只［購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001］，體質(zhì)量200～220 g，體質(zhì)量降次排序，按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為PM2.5一次染毒組（P1）、PM2.5三次染毒（P3）、鹽水對照染毒組（N）、空白對照組（O），每組8只。大鼠在無特定病原體（SPF）級飼養(yǎng)，同溫（18～20℃）、同濕度（40%～60%），自由飲水，普通食料喂養(yǎng)4周。

1.1.2主要材料儀器及試劑Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；多樣品研磨珠均質(zhì)儀（Omni：Bead Ruptor 12多樣品研磨珠均質(zhì)儀）；臺式高速冷凍型微量離心機(jī)（DragonLab：D3024R）；熒光定量PCR儀（ABI：Stepone plus）；超凈工作臺（蘇凈安泰：SW?CJ?1FD）；標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司：FBZ2001?up?p）；微量移液器（蘇州BIOHIT公司：Proline）；酶標(biāo)儀（美國BIOTEK公司：ELX?800）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特公司：DH36001B）RNA提取液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；HyPureTMMolecular Biology Grade Water（HyClone：SH30538.02）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo：#K1622）；Fast?Start Universal SYBR Green Master（Rox）（Roche：04 913 914 001）；大鼠IL?1β ELISA試劑盒、大鼠白介素?6 ELISA試劑盒、大鼠TNF?α ELISA試劑盒（中國Boster公司）。

1.2方法

1.2.1PM2.5的采集及懸液的制備采于某市環(huán)境監(jiān)測中心提供的11個(gè)監(jiān)測子站和1個(gè)流動(dòng)監(jiān)測站組成的環(huán)境空氣質(zhì)量自動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)，對2016年11月至2017年2月的某市中心PM2.5進(jìn)行采樣，每次采樣時(shí)間為24 h，顆粒物采集在直徑9 cm的玻璃纖維濾膜上，連續(xù)采樣4個(gè)月。纖維濾膜在采樣前恒溫干燥24 h后稱重，采樣結(jié)束后在相同的條件下平衡24 h后，稱重，置于-20℃避光保存。將采樣后的纖維濾膜用Milli?Q超純水洗脫顆粒物，并于低溫冷凍離心機(jī)中以12 000 r/min超速離心，收集細(xì)顆粒物懸浮液進(jìn)行真空冷凍干燥，-80℃保存。實(shí)驗(yàn)前稱取干燥的細(xì)顆粒物用生理鹽水配制濃度為2 mg/mL的顆粒物混懸液，超聲振蕩5 min使顆粒物混勻并滅菌。

1.2.2動(dòng)物模型的建立將3組染毒組大鼠（飼養(yǎng)4周后，老鼠體質(zhì)量300～350 g）經(jīng)乙醚麻醉處理后，應(yīng)用氣管滴注法［10］進(jìn)行染毒。P1組給予每只大鼠30 mg/kg的PM2.5染毒（PM2.5懸液，濃度為2 mg/mL）。P3組分別在第1、3、6天進(jìn)行麻醉染毒，每次PM2.5染毒劑量相同。N組應(yīng)用同樣方法，給予相同劑量的鹽水染毒。O組不做任何處理。在各組最終染毒后的24 h后進(jìn)行10%的水合氯醛腹腔麻醉，進(jìn)行標(biāo)本取材。

1.2.3標(biāo)本采集

1.2.3.1動(dòng)脈血將麻醉的大鼠仰臥固定于操作板上，暴露大鼠腹腔，找到腹主動(dòng)脈，用20 mL注射器抽取動(dòng)脈血10 mL，用低速離心機(jī)以3 000 r/min離心15 min，留取上清液于-80℃保存，用于檢測TNF?α、IL?6、IL?1β炎性指標(biāo)。

1.2.3.2肺組織取下肺葉，由肺門至肺緣作最大切面。一部分肺組織加入Trizol保存液，保存在-80℃中，用于檢測miR?155，其余肺組織浸泡于10%中性甲醛中固定4 h，用于石蠟固定保存及常規(guī)制備5 μm石蠟切片進(jìn)行HE染色觀察病理改變，并進(jìn)行病理評分。氣管炎癥的病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)［11］：選取直徑為300 ～ 1 000 μm的支氣管，觀察以下指標(biāo)：（1）上皮脫落、糜爛和潰瘍形成；（2）上皮杯狀細(xì)胞增生肥大；（3）黏膜上皮纖毛倒伏；（4）管壁有炎癥細(xì)胞浸潤，管腔有滲出；（5）管壁有淋巴小結(jié)形成；（6）支氣管管腔狹窄；（7）呼吸道平滑肌增殖紊亂；（8）氣管管壁結(jié)締組織增生；（9）黏膜細(xì)胞鱗狀化生；（10）管壁充血、水腫；（11）管壁色素沉積。各項(xiàng)指標(biāo)滿分為3分，各病理切片任意選取3個(gè)小氣管，每項(xiàng)指標(biāo)得分=總分×100/3。每只大鼠的病理學(xué)評分為得分和×100/33。

1.2.3.3miR?155的檢測總RNA抽提：取100 mg組織于勻漿器充分研磨，12 000 r/min離心10 min取上清，加入250 μL三氯甲烷，充分混勻，靜置3 min，4℃ 下12 000 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置15 min，4℃下12 000 r/min離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA，吸除液體，加入75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀，4℃下12 000 r/min離心5 min，將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3 min，加入15 μL無RNA酶的水溶解RNA，55℃ 孵育5 min，使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度，檢測吸光值，將濃度過高的RNA進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋，使其終濃度為200 ng/μL。PCR反轉(zhuǎn)錄條件：65℃、5 min，42℃、60 min，80℃、5 min，PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃、10 min，循環(huán)（40次）95℃、15 s→60℃、60 s，溶解曲線75℃→95℃，每20秒升溫1℃，處理方法：ΔΔCT法：A=CT（目的基因，待測樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本），B=CT（目的基因，對照樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本），K=A-B，表達(dá)倍數(shù)=2-K。表1為逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR序列［12］。

表1　引物信息表Tab.1　Primers list

1.2.3.4TNF?α、IL?6、IL?1β的檢測采用雙抗體夾心ELISA法檢測各組大鼠血清中的TNF?α、IL?6、IL?1β，完全按照試劑盒說明說進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)分析評估血清miR?155的表達(dá)分別與TNF?α、IL?6、IL?1β之間的關(guān)系，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況空白對照組大鼠活潑好動(dòng)，皮毛光亮，體形肥胖，強(qiáng)壯，呼吸平穩(wěn)。鹽水對照組染毒后略有少許噴嚏，數(shù)小時(shí)后癥狀消失。染毒組染毒后出現(xiàn)咳嗽、噴嚏，活動(dòng)量減少，食量減少，不活潑等癥狀。三次染毒組大鼠除了活動(dòng)減少及食量減少，又出現(xiàn)拱背蜷臥，且咳嗽、噴嚏更加頻繁，呼吸加深且急促等癥狀，且染毒組咳嗽及噴嚏數(shù)小時(shí)不見緩解。

2.2各組大鼠血清中TNF?α、IL?6、IL?1β的表達(dá)結(jié)果3組干預(yù)組中炎性指標(biāo)TNF?α、IL?6、IL?1β的表達(dá)較O組均有顯著增加，P3組炎性因子表達(dá)高于P1組和N組，P1組炎性因子表達(dá)較N組增加，且4組炎性指標(biāo)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見表2。

表2　各組大鼠血清TNF?α、IL?6、IL?1β表達(dá)水平的變化Tab.2　Changes of serum TNF?α、IL?6、IL?1β expression levels in rats ±s，pg/mL

表2　各組大鼠血清TNF?α、IL?6、IL?1β表達(dá)水平的變化Tab.2　Changes of serum TNF?α、IL?6、IL?1β expression levels in rats ±s，pg/mL

注：與對照組相比，aP＜0.01，bP＜0.01

組別PM2.5一次染毒組PM2.5三次染毒組鹽水對照染毒組空白對照組F值P值鼠數(shù)8　8　8　8 TNF?α 357.3±94.5a 648.2±83.9b 201.8±37.9 164.9±27.8 85.07＜0.01 IL?6 997.7±179.7a 1 279.6±203.8b 573.6±48.8 422.4±62.5 61.42＜0.01 IL?1β 846.2±154.0a 1 154.6±189.5b 659.8±114.3 503.8±139.2 27.19＜0.01

2.3各組大鼠肺組織HE染色病理結(jié)果見圖1，O組大鼠肺泡大小均勻，氣管可見柱狀上皮細(xì)胞，肺泡結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列較整齊，肺間質(zhì)及肺泡腔無明顯炎性細(xì)胞浸潤、出血；P1組、P3組、N組均見肺間質(zhì)水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、大量肺泡腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤，P3組肺泡壁破壞程度、肺泡間充血量以及炎性細(xì)胞浸潤量最嚴(yán)重，P1組較P3組病理改變程度輕，較N組病理改變程度重。各組肺組織氣管炎癥的病理學(xué)評分比較見表3。

2.4各組大鼠肺組織miR?155的表達(dá)結(jié)果O組中miR?155表達(dá)量（0.22±0.06）最低，P3組miR?155表達(dá)量（2.36±1.18）最大，P1組表達(dá)（01.77±0.33）和N組表達(dá)（0.36±0.15）較其表達(dá)少，且各組進(jìn)行相關(guān)分析具有顯著差異（F=20.19，P＜0.01）。

圖1　各組SD大鼠肺組織病理光鏡觀察Fig.1　Pathological light microscopic observation of SD rats′lung tissue in each group

表3　各組大鼠氣管炎癥病理學(xué)評分Tab.3　Pathological scores of trachea of rats in each group±s

表3　各組大鼠氣管炎癥病理學(xué)評分Tab.3　Pathological scores of trachea of rats in each group±s

注：與對照組相比，aP＜0.01，bP＜0.01

組別PM2.5一次染毒組PM2.5三次染毒組鹽水對照染毒組空白對照組F值P值鼠數(shù)8888氣道數(shù)24 24 24 24病理評分63.19±4.76a 81.37±8.46b 34.19±3.79 13.93±3.45 170.00 0.00

2.5miR?155與TNF?α、IL?6、IL?1β表達(dá)水平的相關(guān)分析Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，肺組織miR?155與血清中TNF?α、IL?6、IL?1β的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.768，0.752，0.729；P＜ 0.01），見圖3。

3　討論

圖3　miR?155與TNF?α、IL?6、IL?1β的相關(guān)分析圖Fig.3　Correlation analysis of miR?155 and TNF?α，IL?6，IL?1β

PM2.5具有粒徑小，表面積大，且可吸附多種有毒有害物質(zhì)的特點(diǎn)，可以深入沉積在呼吸道細(xì)支氣管和肺泡內(nèi)，其中細(xì)小的成分甚至可以穿過肺間質(zhì)，進(jìn)入血液循環(huán)，對機(jī)體全身造成有害影響［13］。miRNAs（microRNAs）是一類高度保守的短鏈非編碼RNA，調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞生長、分化、代謝、凋亡等多個(gè)生物學(xué)過程［14］。miR?155是miRNAs的主要成員之一，被認(rèn)為是一種典型的能針對不同基因起作用調(diào)控多種生物途徑的微小RNA，可通過調(diào)節(jié)靶向miRNA以及介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)來參與如肺癌、哮喘、肺炎、肺結(jié)核及急性肺損傷等肺部疾病的形成。在ZHENG等［15］動(dòng)物試驗(yàn)中顯示miR?155可有效地增加促炎反應(yīng)分子TNF?α、IL?6和NO的釋放。RODRIGUEZ等［16］研究發(fā)現(xiàn)miR?155在小鼠肺部炎中的作用，并證實(shí)了miR?155在調(diào)節(jié)與T細(xì)胞功能相關(guān)的基因表達(dá)和炎癥反應(yīng)方面的重要作用。WANG等［17］在以鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的LPS（脂多糖）所致肺損傷的模型中得出，miR?155可以通過抑制其下游的靶標(biāo)?沉默細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（suppressor of cyto?kine signaling，SOCS?1）表達(dá)而導(dǎo)致肺損傷的形成。

本實(shí)驗(yàn)采用氣管滴注法對SD大鼠進(jìn)行PM2.5染毒制作動(dòng)物模型。通過SD大鼠肺組織HE染色病理切片結(jié)果顯示，PM2.5對肺部組織具有炎性損傷作用，并隨著染毒次數(shù)及劑量的增加，其破壞程度逐漸加重。通常情況下，血清中的炎性因子處于低表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，其表達(dá)可顯著增加。本實(shí)驗(yàn)通過檢測SD大鼠血清中TNF?α、IL?6、IL?1β炎性指標(biāo)可發(fā)現(xiàn)，血清中TNF?α、IL?6、IL?1β隨著PM2.5的染毒增加而表達(dá)增強(qiáng)，提示PM2.5所致炎性反應(yīng)隨染毒次數(shù)及劑量增加而增強(qiáng)。由此可見，PM2.5對肺部的炎性損傷作用隨著PM2.5接觸的增加而增強(qiáng)。

通過檢測各組大鼠肺組織中miR?155的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)P3組miR?155表達(dá)量最大，P1組表達(dá)較其次之，N組和O組表達(dá)較少，且各組進(jìn)行相關(guān)分析具有顯著差異。對miR?155與TNF?α、IL?6、IL?1β的表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果示miR?155與TNF?α、IL?6、IL?1β存在正向相關(guān)（P＜ 0.01）。

本研究證實(shí)了PM2.5對肺部的炎性損傷作用，且隨著PM2.5接觸量的增加，損傷作用逐漸增強(qiáng)。同時(shí)通過檢測miR?155的表達(dá)量及相關(guān)性分析可發(fā)現(xiàn)，miR?155的表達(dá)增加與PM2.5所致的肺部炎性反應(yīng)相關(guān)，因此，miR?155可能參與PM2.5致肺的炎性反應(yīng)中，為PM2.5致肺損傷的研究提供一個(gè)新的思路，但由于其具體通路及機(jī)制尚不清晰，有待于進(jìn)一步研究。

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