三疣梭子蟹F型ATP酶β亞基(F-ATPaseβ)基因的克隆、組織表達(dá)及在家系近交中的變化*

王竹青 任憲云 高保全 劉 萍 張小輝 張 杰 于 旋

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三疣梭子蟹F型ATP酶β亞基()基因的克隆、組織表達(dá)及在家系近交中的變化*

王竹青1,2任憲云2高保全2劉 萍2①張小輝1,2張 杰1,2于 旋2

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 2. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

采用RACE技術(shù)(cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù))克隆獲得三疣梭子蟹() F型ATP酶b亞基()基因，命名為。該基因cDNA全長為1965 bp，5￠和3￠非編碼區(qū)分別為571 bp和341 bp，開放閱讀框?yàn)?053 bp，推測編碼350個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為 37.9 kDa，理論等電點(diǎn)為4.86。F-ATPaseβ氨基酸序列含有F1-ATPaseβ標(biāo)志性蛋白結(jié)構(gòu)域、AAA結(jié)構(gòu)域和ATP-synt-ab-C結(jié)構(gòu)域。同源性及系統(tǒng)分析顯示，F(xiàn)-ATPaseβ氨基酸序列與斑節(jié)對(duì)蝦()、凡納濱對(duì)蝦()同源性高達(dá)89%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，基因在肝胰腺、肌肉、心臟、鰓、胃、腸、精巢和卵巢中均有表達(dá)，其中，在肝胰腺和心臟中表達(dá)量最高，在腸中最少。隨著近交系數(shù)的增加，各代基因的表達(dá)量在肝胰腺和心臟中均下降且顯著低于F0代(<0.05)。酶活檢測結(jié)果顯示，心臟中的ATP合酶活性從F6代開始出現(xiàn)下降且顯著低于F0代(<0.05)，但肝胰腺中ATP合酶活性無顯著變化。本研究結(jié)果表明，近交造成了三疣梭子蟹基因表達(dá)及ATP合酶活力的衰退。

三疣梭子蟹；；基因克?。槐磉_(dá)分析；近交

ATP合酶又稱F型ATP酶(F-ATPase)，廣泛分布于線粒體內(nèi)膜上，是生物體能量代謝的關(guān)鍵酶，在生物體內(nèi)通過氧化磷酸化和光合磷酸化參與到ATP的合成過程(王鏡巖等, 2002)。ATP合酶是一個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體，呈蘑菇狀，分為球形的F1(頭部)和嵌入膜內(nèi)的F0(基部)。F1是由5種多肽組成的α3β3γδε復(fù)合體，具有3個(gè)ATP合成催化位點(diǎn)，而只有β亞基可催化ATP的合成反應(yīng)。F0是由3個(gè)多肽組成的ab2c12復(fù)合體，并嵌入線粒體內(nèi)膜(倪張林等, 2003)。ATP合酶β亞基在植物葉綠體和線粒體中的研究較多，證明其功能與植物體胚發(fā)育(賴呈純等, 2010){賴呈純, 2010 #101}、鹽度適應(yīng)(李敏等, 2013)、次生代謝(關(guān)蕾, 2013)等有關(guān)。在水產(chǎn)動(dòng)物中對(duì)ATP合酶β亞基研究較少。Li等(2009)發(fā)現(xiàn)，ATP合酶β亞基與無脊椎動(dòng)物造血激素存在特異性結(jié)合作用。徐萌霖(2013)發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦()ATP合酶β亞基BP53蛋白可作為受體參與對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的感染，并證明了凡納濱對(duì)蝦造血激素和WSSV的粘附蛋白V37分別與ATP合酶β亞基存在特異性結(jié)合作用。

三疣梭子蟹()ATP酶的研究僅限于P型ATP酶，比如Na+/K+-ATPase酶和Ca2+/ Mg2+-ATPase酶，并證明其參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)和滲透壓調(diào)節(jié)等作用(周東等, 2014; 韓曉琳等, 2012; 江山等, 2011)。ATP合酶在三疣梭子蟹生長發(fā)育、能量代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，但對(duì)三疣梭子蟹ATP合酶的研究尚未見報(bào)道，而且目前三疣梭子蟹亞基全長cDNA序列尚未被克隆。通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的分析與篩選，發(fā)現(xiàn)自交7代的大個(gè)體組相對(duì)于小個(gè)體組有2869個(gè)差異表達(dá)的基因。通過對(duì)差異基因開展進(jìn)一步生物學(xué)進(jìn)程KEGG富集分析，篩選出的差異基因富集的代謝通路主要有氧化磷酸化通路、細(xì)胞凋亡通路和對(duì)應(yīng)外界刺激。因此，研究三疣梭子蟹ATP合酶對(duì)于深入研究其氧化磷酸化等代謝通路有著極其重要的作用。已有研究表明，近交能引起三疣梭子蟹能量代謝相關(guān)基因及代謝酶活力的衰退，但是否也能引起ATP合酶基因及酶活力的衰退還有待研究。

本研究利用RACE技術(shù)首次成功克隆得到三疣梭子蟹亞基基因的cDNA全長序列，命名為，并對(duì)得到的序列進(jìn)行生物信息分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)分析了該基因在三疣梭子蟹不同組織以及不同近交世代家系的肝胰腺和心臟中的表達(dá)情況。旨在明確三疣梭子蟹ATP合酶β亞基基因的表達(dá)特點(diǎn)，揭示近交程度對(duì)該基因表達(dá)及其酶活力的影響，為深入研究三疣梭子蟹能量代謝機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

自2005年，本實(shí)驗(yàn)室每年將從山東萊州灣海區(qū)、遼寧鴨綠江口海區(qū)、江蘇海州灣海區(qū)和浙江舟山海區(qū)獲取的4個(gè)三疣梭子蟹不同地理群體作為基礎(chǔ)群體，在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)基地濰坊昌邑海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司利用人工定向交尾技術(shù)，建立了全同胞兄妹交傳代家系。良種家系留種傳代，至2015年已傳至11代(F11)。分別選取80日齡F0、F2、F4、F6、F8和F10近交世代家系的三疣梭子蟹，每代各取6只 (3只雌蟹、3只雄蟹)，暫養(yǎng)于室內(nèi)水泥池中，水池底面積為20 m2，高度為1.5 m，池水深保持在20~30 cm，水溫為(25.0±0.5)℃，溶解氧為5.5 mg/L，鹽度為31，pH為8.2。暫養(yǎng)7 d，每日08:00定時(shí)換掉1/2的水，16:00投喂新鮮野雜魚，投喂量為蟹體重的1/10。

1.2 三疣梭子蟹總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

三疣梭子蟹各組織的總RNA采用Trizol法提取，用核酸定量儀(Thermo, NanoDrop 2000)與1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其總RNA的質(zhì)量及完整性。取等量所取各組織的總RNA混勻，合成3￠和5￠RACE的cDNA第一鏈，具體方法參照SMARTTMRACE Amplification Kit說明書。

1.3 三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因全長cDNA的克隆及驗(yàn)證

根據(jù)從三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫得到的基因的EST序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3￠和5￠末端特異性引物。根據(jù)克隆出的基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物。最后在該基因的兩端設(shè)計(jì)正反向引物，進(jìn)行全長cDNA的驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)中用到的末端特異性引物和熒光定量引物分別由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司和上海生工生物有限公司合成(表1)。利用TaKaRa LA進(jìn)行末端擴(kuò)增，3￠端用通用引物UPM和NUP分別與相應(yīng)的特異性引物ATPase-F1和ATPase-F2進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，PCR程序：94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；5￠末端擴(kuò)增同上。

表1 三疣梭子蟹克隆和mRNA相對(duì)表達(dá)分析所用引物序列

Tab.1 Primers used for ptF-ATPaseβ cloning and relative mRNA expression analysis

將3￠和5￠RACE的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up試劑盒(TaKaRa)切膠純化并連接到pMD19-T，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)45 min后，再將菌液涂布于含AMP的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性菌落繼續(xù)培養(yǎng)，并進(jìn)行菌落PCR鑒定后送交青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。最后利用在基因的兩端設(shè)計(jì)的正反向引物，對(duì)其全長cDNA進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因的生物學(xué)分析

使用ORF Finding在線工具確定基因最大開放閱讀框和編碼區(qū)。利用NCBI中的BLAST主頁程序進(jìn)行三疣梭子蟹基因的核苷酸和氨基酸序列的比對(duì)。利用CExpres和Gene Tool軟件拼接比對(duì)核苷酸序列、去除冗余序列和翻譯氨基酸。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測、功能結(jié)構(gòu)域分析、信號(hào)肽分析利用InterProScan和SMART等在線軟件完成。利用DNAMAN進(jìn)行F-ATPaseβ與其他物種的相應(yīng)氨基酸序列的多重序列比對(duì)。利用MEGA 6.0軟件，以鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行聚類分析。

1.5 三疣梭子蟹線粒體的提取及ATP合酶活性測定

分別取不同近交世代家系的三疣梭子蟹肝胰腺、心臟，每2只螃蟹(1雌1雄)的組織放入一個(gè)凍存管中，存放于液氮中保存。用研缽將采集的組織樣品在液氮中研磨，每個(gè)凍存管單獨(dú)研磨，取100 mg左右的組織粉末加入2 ml EP管中，分別標(biāo)記后放入-80℃冰箱中保存。

分別利用南京建成線粒體提取試劑盒和蛋白定量測試盒提取所取組織的線粒體并測定其蛋白濃度。使用ATP合成酶活性光譜法定量檢測試劑盒在infinite 200酶標(biāo)儀中分別測定不同世代家系三疣梭子蟹各組織ATP合酶活力，具體操作參照該試劑盒說明書進(jìn)行。ATP合酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH=7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1 mol還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量為1個(gè)活性單位。

1.6 三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因的表達(dá)定量分析

分別取三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、鰓、心臟、胃、腸、精巢和卵巢及不同近交世代家系的三疣梭子蟹肝胰腺、心臟等組織，每2只螃蟹(1雌1雄)的組織放入一個(gè)凍存管中，存放于液氮中保存。用Trizol試劑提取三疣梭子蟹所取組織的總RNA，利用核酸定量儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量和完整性，使用PrimeScript RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體方法參照試劑盒說明書。

根據(jù)已知的三疣梭子蟹基因cDNA全長序列，設(shè)計(jì)1對(duì)正反特異引物(QATPase-F和QATPase-R)(表1)。使用SYBR Premix ExⅡ試劑(TaKaRa)，在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀上分析各組織中基因的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)體系為10 μl，包括5 μl SYBR Premix ExⅡ、1 μl cDNA、0.4 μl濃度為10 pmol/μl正反向引物、0.2 μl ROX Reference dye Ⅱ和3 μl PCR反應(yīng)水。反應(yīng)程序：95℃ 10 min；95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃15 s。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，樣本和內(nèi)參均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用2-DDCt方法(Livak, 2001)計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)三疣梭子蟹ATP合酶活性及相對(duì)定量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示；結(jié)果使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan′s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，<0.05為差異顯著。最后應(yīng)用Origin 2016軟件作圖。

有些留學(xué)生希望能了解更多的臨床知識(shí)，有的學(xué)生打算選擇心臟兒科作為將來進(jìn)一步學(xué)習(xí)和深造的方向，我們就利用課余時(shí)間讓學(xué)生走進(jìn)病房，盡可能多地介紹先天性心臟病的診療常規(guī)，給這些學(xué)生深入學(xué)習(xí)的機(jī)會(huì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹ptF-ATPaseβ基因全長cDNA的克隆及驗(yàn)證

三疣梭子蟹基因的EST序列長1692 bp，用BLAST對(duì)序列進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)果顯示，該序列與其他物種的基因的相似度在79%以上。3￠RACE擴(kuò)增結(jié)果得到517 bp的cDNA片段，5'RACE擴(kuò)增結(jié)果得到303 bp的cDNA片段。將這2個(gè)片段與已知EST序列進(jìn)行拼接得到三疣梭子蟹基因的全長cDNA序列，并命名為。對(duì)該基因cDNA序列全長進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的大小為1745 bp的序列完全覆蓋的開放閱讀框(ORF)，表明得到的cDNA序列準(zhǔn)確可靠。三疣梭子蟹基因的cDNA序列全長為1965 bp (GenBank登錄號(hào)KY130458)，其中包含1053 bp的ORF，571 bp的5￠端非編碼區(qū)(UTR)和341 bp的3￠端UTR，3￠端存在多聚腺苷酸Poly A尾(圖1)。

2.2 三疣梭子蟹ptF-ATPaseβ基因序列的生物信息學(xué)分析

ExPASy ProtParam tool在線軟件分析顯示，三疣梭子蟹基因編碼一個(gè)由350個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，理論等電點(diǎn)為4.86，分子量為37.9 kDa，推測其原子總數(shù)為5338，分子式為C1682H2675N447O524S10。該蛋白由18種氨基酸組成，包括甘氨酸(9.4%)、纈氨酸(9.1%)、丙氨酸(8.9%)、亮氨酸(8.3%)、絲氨酸(6.6%)、谷氨酰胺(6.6%)、異亮氨酸(6.6%)、蘇氨酸(6.6%)、天冬氨酸(6.0%)、谷氨酰胺(5.4%)、精氨酸(4.3%)、賴氨酸(4.3%)、苯丙氨酸(4.0%)、脯氨酸(4.0%)、酪氨酸(3.4%)、蛋氨酸(2.9%)、天冬酰胺(2.3%)、組氨酸(1.4%)，帶負(fù)電的氨基酸殘基為44個(gè)(Asp和Glu)，帶正電的氨基酸殘基為30個(gè)(Arg和Lys)，親水性平均數(shù)為–0.040，不穩(wěn)定系數(shù)為39.45，屬于穩(wěn)定蛋白。SMART和SignalP 3.0在線軟件分析表明，該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽序列，且其第1~235位為F1-ATPaseβ標(biāo)志性蛋白結(jié)構(gòu)域(IPR005722)，其中，第23~207位為AAA(ATPases associated with a variety of cellular activities)結(jié)構(gòu)域(IPR003593)，第243~348位為ATP-synt-ab-C結(jié)構(gòu)域(IPR024034)(圖2)。

圖1 三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因cDNA全長及其編碼的氨基酸序列

ATG：起始密碼子；*：終止密碼子；陰影為P-loop-NTPase superfamily結(jié)構(gòu)域；方框中為ATP-synt-ab-C superfamily結(jié)構(gòu)域；下劃線為ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)基序A (P-loop)；加粗斜體為ATP合酶α和β亞基特征位點(diǎn)

ATG: start codon; *: stop codon; Shadow: P-loop-NTPase superfamily domain; Block: ATP-synt-ab-C superfamily domain; Underline: ATP/GTP-binding motif A (P-loop); Bold and italic: ATP synthase α and β subunits signature

圖2 三疣梭子蟹F-ATPaseβ蛋白結(jié)構(gòu)域分析

InterProScan軟件分析結(jié)果顯示，F(xiàn)-ATPaseβ蛋白質(zhì)存在5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)SSK、TTK、TSR、TAR和TIR，7個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)SLND、TVAE、SMQE、SLQD、SEED、SLQD和SFEE，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)RGIAELGIY，8個(gè)N端?；稽c(diǎn)GGKIGL、GLFGGA、GAGVGK、GVGKTV、GLTVAE、GSEVSA、GSITSV和GIYPAV，1個(gè)ATP合酶α和β亞基特征位點(diǎn)PAVDPLDSTS，1個(gè)ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)基序A(P-loop)GGAGVGKT。通過CLC Main Workbench 5.6軟件分析其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含104個(gè)α-螺旋(27.91%)，169個(gè)無規(guī)則卷曲(48.29%) (圖3)。

2.3 三疣梭子蟹ptF-ATPaseβ基因序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用BLAST同源性分析三疣梭子蟹基因的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其與斑節(jié)對(duì)蝦()、凡納濱對(duì)蝦()同源性達(dá)到89%，與日本囊對(duì)蝦()、中國對(duì)蝦()、克氏原螯蝦()、豌豆長管蚜()、玉帶鳳蝶()的同源性分別為88%、88%、87%、86%和86%(圖4)。

利用MEGA 6.0軟件對(duì)三疣梭子蟹F-ATPaseβ氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示，18個(gè)物種中，三疣梭子蟹與克氏原螯蝦親緣關(guān)系較近，與魚類、哺乳類關(guān)系較遠(yuǎn)。在對(duì)蝦中，斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦、日本囊對(duì)蝦和中國對(duì)蝦緊密聚為一支，之后與三疣梭子蟹聚為一支。

圖3 三疣梭子蟹F-ATPaseβ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

藍(lán)色代表α螺旋，紅色代表延伸鏈，紫色代表無規(guī)則卷曲

Alpha helix is indicated by blue, extended strand is indicated by red, random coil is indicated by purple

圖4 三疣梭子蟹F-ATPaseβ氨基酸序列與其他物種的F-ATPaseβ氨基酸序列比對(duì)

方框中為ATP合酶α和β亞基特征位點(diǎn)；圓方框中為ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)基序A (P-loop)；下劃線為酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)

Box: ATP synthase α and β subunits signature; Rounded rectangle: ATP/GTP-binding motif A(P-loop); Underline: Tyrosine kinase phosphorylation site

2.4 三疣梭子蟹ptF-ATPaseβ基因在各個(gè)組織中的表達(dá)情況

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，分析了三疣梭子蟹基因在各組織中的表達(dá)情況(圖6)。結(jié)果顯示，該基因在8個(gè)組織中均有表達(dá)，在肝胰腺、心臟和精巢中表達(dá)量最高，其次是胃、肌肉、鰓、卵巢，在腸中的表達(dá)量最少。

2.5 近交家系三疣梭子蟹ATP合酶活力及ptF-ATPaseβ基因的表達(dá)情況

三疣梭子蟹肝胰腺中的ATP合酶活性高于心臟中的活性，約是心臟中活性的2倍(圖7)。隨著近交系數(shù)的增加，心臟中的ATP合酶活性總體呈現(xiàn)顯著下降趨勢；F2和F4代心臟中的ATP合酶活性與F0代無顯著差異，而從F6代開始ATP合酶活力出現(xiàn)下降且顯著低于F0代(<0.05) (圖7b)。而肝胰腺中的ATP合酶活性無顯著變化(圖7a)。

3 討論

ATP合酶廣泛存在于真核生物線粒體內(nèi)膜、葉綠體類囊體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌的質(zhì)膜上，參與生物體氧化磷酸化和光合磷酸化作用，在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢的推動(dòng)下合成ATP，是生物體能量代謝的關(guān)鍵酶(王鏡巖等, 2002)。ATP合酶主要由F1和F0組成，不同物種的ATP合酶所含的亞基及數(shù)目不盡相同。F1由亞基α3β3γδε組成，其中，β亞基是酶的催化核心，其構(gòu)象的變化使它能夠結(jié)合ADP和ATP，驅(qū)動(dòng)著ATP的合成和水解(Boyer, 1989、1997)。β亞基不僅參與催化作用，它還可位于生物膜表面參與各種生理功能(Champagne, 2006)，因此，對(duì)三疣梭子蟹ATP合酶β亞基的研究對(duì)于其能量代謝的研究具有重要作用。目前，ATP合酶β亞基在植物葉綠體和線粒體中的研究較多，證明其功能與植物體胚發(fā)育、鹽度適應(yīng)、次生代謝等有關(guān)，而三疣梭子蟹ATP合酶的研究尚未見報(bào)道。

圖5 MEGA 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建的三疣梭子蟹與其他物種的F-ATPaseβ氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹

各物種基因登錄號(hào)：斑節(jié)對(duì)蝦(AEB92164.1)，凡納濱對(duì)蝦(ACB36913.1)，日本囊對(duì)蝦(ACM91676.1)，中國對(duì)蝦(ACM91675.1)，克氏原螯蝦(ACU31053.1)，牡蠣(EKC39411.1)，沙漠蝗(AEV89780.1)，斑馬魚(NP_001019600.2)，鯉魚(BAA82837.1)，果蠅(NP_001259081.1)，大型溞(JAN00926.1)，黑脈金斑蝶(EHJ67407.1)，牛(NP_786990.1)，家鼠(AAB86421.1)，黑猩猩(XP_003824956.1)，人(AAA51808.1)

GenBank accession numbers of different species:(AEB92164.1),(ACB36913.1),(ACM91676.1),(ACM91675.1),(ACU31053.1),(EKC39411.1),(AEV89780.1),(NP_001019600.2),(BAA82837.1),(NP_001259081.1),(JAN00926.1),(EHJ67407.1),(NP_786990.1),(AAB86421.1),(XP_003824956.1),(AAA51808.1)

圖6 三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因在各組織中的表達(dá)情況

不同組織表達(dá)量均以與胃相比較的倍數(shù)表示。不同字母表示差異顯著(<0.05)，下同

The expression in different tissues was presented as the fold compared to the level in the stomach. Different letters indicated significant differences (<0.05). The same as below

本實(shí)驗(yàn)克隆得到的三疣梭子蟹基因的cDNA序列全長為1965 bp。與其他動(dòng)物編碼區(qū)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，三疣梭子蟹基因編碼區(qū)保守性較強(qiáng)。該基因編碼一個(gè)由350個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白具有F-ATPaseβ標(biāo)志性蛋白結(jié)構(gòu)域，無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽序列。該基因編碼的蛋白氨基酸序列與斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦F-ATPaseβ蛋白同源性達(dá)到89%，在系統(tǒng)進(jìn)化中也與對(duì)蝦科聚為一支，因此，對(duì)三疣梭子蟹基因表達(dá)及酶活性的研究可為其他海洋生物相關(guān)的研究提供參考。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因在所研究組織中均有表達(dá)，在肝胰腺、心臟和精巢中表達(dá)量最高，說明三疣梭子蟹肝胰腺、心臟和精巢中的能量代謝比其他組織中旺盛，也證實(shí)了肝胰腺、心臟和精巢是三疣梭子蟹生長和發(fā)育主要供能中心。

圖7 不同近交世代家系三疣梭子蟹肝胰腺(a)和心臟(b)中ATP合酶活力

圖8 不同近交世代家系三疣梭子蟹肝胰腺(a)和心臟(b)中F-ATPaseβ基因相對(duì)表達(dá)量

由于三疣梭子蟹野生苗種的日益匱乏，苗種大多依靠人工養(yǎng)殖的親本提供。然而，在苗種生產(chǎn)過程中不可避免地會(huì)造成群體內(nèi)近交，從而導(dǎo)致了三疣梭子蟹種質(zhì)資源的退化及遺傳多樣性的降低(王好鋒等, 2013; Gao, 2015)。近交通常會(huì)使子代一些與繁殖力或生理機(jī)能相關(guān)的性狀所表現(xiàn)的表型平均值降低(Frankham, 2001)，其程度可以用近交系數(shù)(F, coefficient of inbreeding)來表示。目前的研究已經(jīng)證明，近交會(huì)造成水產(chǎn)動(dòng)物形態(tài)學(xué)(Luan, 2014)、繁殖力(Moss, 2008)、存活和抗逆性(Luo, 2014)等表型性狀方面的衰退，但關(guān)于近交對(duì)生理機(jī)制相關(guān)的影響還鮮有報(bào)道。Ren等(2016)證實(shí)了近交能夠引起三疣梭子蟹酚氧化酶活力及抗氧化機(jī)制等生理機(jī)能的衰退。但目前有關(guān)近交對(duì)三疣梭子蟹能量代謝的影響還未見報(bào)道。

本研究結(jié)果還顯示，隨著近交系數(shù)的增加，心臟中ATP合酶活力呈現(xiàn)顯著降低的趨勢，說明近交引起了三疣梭子蟹心臟ATP活力的衰退，而ATP合酶β亞基基因相對(duì)表達(dá)量同樣是逐代下降。研究表明，激活、過表達(dá)或敲降β亞基基因等會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)ATP的含量(李晶等, 2009)，因此，推測β亞基的下調(diào)表達(dá)造成了三疣梭子蟹心臟ATP合酶活性的下降。肝胰腺是三疣梭子蟹體內(nèi)重要的器官，也是代謝最為活躍的組織，近交同樣造成了三疣梭子蟹肝胰腺中ATP合酶β亞基基因相對(duì)表達(dá)量的衰退，但對(duì)其ATP合酶活力沒有顯著影響。細(xì)胞中某一蛋白在某一時(shí)間的表達(dá)受到多種因素的影響，如基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA的翻譯、蛋白質(zhì)的降解速率等(Gygi, 1999)。盡管mRNA表達(dá)水平在一定程度上反映基因的表達(dá)，但近來越來越多的研究表明，mRNA表達(dá)水平并不能完全代表蛋白質(zhì)的水平，而且蛋白還存在多種多樣的翻譯后加工修飾等(錢小紅等, 2003; Simpson, 2006)。因此，我們預(yù)測三疣梭子蟹肝胰腺中的ATP合酶β亞基基因的表達(dá)與ATP合酶活力不一致可能與代償機(jī)制或酶功效增強(qiáng)有關(guān)，還需同工酶和酶動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究首次成功克隆三疣梭子蟹ATP合酶β亞基基因全長cDNA序列，該序列全長1965 bp，包含1053 bp核苷酸的ORF，編碼一個(gè)由350個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。該基因與其他動(dòng)物ATP合酶β亞基基因的核苷酸序列和預(yù)測氨基酸序列均有著比較高的同源性，可為其他海洋生物相關(guān)的研究提供參考。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測了三疣梭子蟹基因的表達(dá)情況，表明該基因在組織中均有表達(dá)，且在肝胰腺和心臟中相對(duì)表達(dá)量最高。本研究還證明，近交造成了三疣梭子蟹基因表達(dá)和ATP酶活力的衰退，可為三疣梭子蟹的遺傳育種工作提供參考數(shù)據(jù)。

Boyer PD. A perspective of the binding change mechanism for ATP synthesis. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 1989, 3(3): 2164–2178

Boyer PD. The ATP synthase: A splendid molecular machine. Annual Review of Biochemistry, 1997, 66: 717–749

Champagne E, Martinez LO, Collet X,. Ecto-F1F0 ATP synthase/F1 ATPase: Metabolic and immunological functions. Current Opinion in Lipidology, 2006, 17s(3): 279–284

Frankham R, Gilligan DM, Morris D,. Inbreeding and extinction: Effects of purging. Conservation Genetics, 2001, 2(3): 279–284

Gao BQ, Liu P, Li J,. Effect of inbreeding on growth and genetic diversity ofbased on the full-sibling inbreeding families. Aquaculture International, 2015, 23(6): 1401–1410

Guan L. Effects of sodium hydrosulfide on antioxidant system and MSAP analysis ofunder high light stress. Master′s Thesis of Anhui Agricultural University, 2013, 5 [關(guān)蕾. 強(qiáng)光脅迫下外源硫化氫對(duì)石斛抗氧化系統(tǒng)的影響及MSAP分析. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2013, 5]

Gygi SP, Rochon Y, Franza BR,. Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Molecular & Cellular Biology, 1999, 19(3): 1720–1730

Han XL, Liu P, Gao BQ,. Molecular cloning and salinity-related expression of Na+/K+-ATPase α-subunit in. Academic Annual Meeting of China Fisheries Society, 2012 [韓曉琳, 劉萍, 高保全, 等. 三疣梭子蟹Na+/K+-ATPase α-亞基的克隆與表達(dá). 中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì), 2012]

Jiang S, Xu QH. Influence of salinity stress on the activity of gill Na+/K+-ATPase in swimming crab (). Journal of Fisheries of China, 2011, 35(10): 1475–1480 [江山, 許強(qiáng)華. 鹽度脅迫對(duì)三疣梭子蟹鰓Na+/K+-ATPase酶活的影響. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2011, 35(10): 1475–1480]

Lai CC, Lai ZX, Fang ZZ,. Cloning of mitochondrial F1-ATPase beta subunit gene fromand its expression analysis by qRT-PCR during somatic embryogenesis in Longan. Scientia Agricultura Sinica, 2010, 43(16): 3392–3401 [賴呈純, 賴鐘雄, 方智振, 等. 龍眼胚性愈傷組織線粒體ATP合酶β亞基基因克隆及其在龍眼體胚發(fā)生過程中的表達(dá)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43(16): 3392–3401]

Li J, Zhang Y, Guan YF,. Effects of ATP synthesis decline on β-cell insulin secretion disorder. Advances in Physiological Sciences, 2009, 40(1): 47–50 [李晶, 張園, 管又飛, 等. ATP合成下降在β細(xì)胞胰島素分泌障礙中的作用. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2009, 40(1): 47–50]

Li M, Zhang J, Feng LG,. Cloning and expression analysis of vacuolar ATPase B subunit gene VHA-B in leaves of salt-stressed willow. Jiangsu Journal of Agricultural Science, 2013, 29(5): 1149–1153 [李敏, 張健, 馮立國, 等. 柳樹液泡膜ATP酶B亞基基因克隆及在鹽脅迫下的表達(dá)分析. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 29(5): 1149–1153]

Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCtmethod. Methods, 2001, 25(4): 402–408

Luan S, Yang GL, Wang J,. Selection responses in survival ofafter performing five generations of multi-trait selection for growth and survival. Aquaculture International, 2014, 22(3): 993–1007

Luo K, Kong J, Luan S,. Effect of inbreeding on survival, WSSV tolerance and growth at the postlarval stage of experimental full-sibling inbred populations of the Chinese shrimp. Aquaculture, 2014, 420– 421(3): 32–37

Moss DR, Arce SM, Otoshi CA,. Inbreeding effects on hatchery and growout performance of pacific white shrimp,(). Journal of the World Aquaculture Society, 2008, 39(4): 467–476

Ni ZL, Wei JM. The structure and catalytic mechanism of ATP Synthase. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 2003, 29(5): 367–374 [倪張林, 魏家綿. ATP合酶的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 29(5): 367–374]

Qian XH, He FC. Proteomics: Theories and methods. Beijing: Science Press, 2003, 1–18 [錢小紅, 賀福初. 蛋白質(zhì)組學(xué): 理論與方法. 北京: 科學(xué)出版社, 2003]

Ren X, Gao B, Liu X,. Comparison of immune responses and antioxidant status of different generations of growth- selectedfamilies. Aquaculture Research, 2016, 2017, 48, 1315–1326

Simpson RJ. Proteins and Proteomics: A laboratory manual. Journal of Proteome Research, 2003, 3(4): 694

Wang HF, Liu P, Gao BQ,. Inbreeding influence to some economic traits of six inbreeding generations of. Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(6): 1157–1165 [王好鋒, 劉萍, 高保全, 等. 近交對(duì)三疣梭子蟹若干經(jīng)濟(jì)性狀衰退的影響. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2013, 20(6): 1157–1165]

Wang JY, Zhu SG, Xu CF. Biochemistry, 3rd ed. Beijing: Higher Education Press, 2002 [王鏡巖, 朱圣庚, 徐長法. 生物化學(xué). 第3版. 北京: 高等教育出版社, 2002]

Xu ML. The interactive identification among LvAST, WSSV- VP37 and F1F0-ATP synthase β subunit of. Master′s Thesis of Ocean University of China, 2013, 3 [徐萌霖. 凡納濱對(duì)蝦造血激素、F1F0-ATP合酶β亞基和WSSV-VP37的相互作用研究. 中國海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2013, 3]

Zhou D, Mu CK, Song WW,. Effects of low salinity stress on the antioxidant enzyme and ATPase activities in tissues of swimming crab. Ecological Science, 2014, 33(4): 698–703 [周東, 母昌考, 宋微微, 等. 低鹽脅迫對(duì)三疣梭子蟹組織中抗氧化酶和ATP酶活力的影響. 生態(tài)科學(xué), 2014, 33(4): 698–703]

(編輯 馮小花)

cDNA Cloning and Expression Analysis ofSubunit Gene inand Its Variation in Family Inbreeding

WANG Zhuqing1,2, REN Xianyun2, GAO Baoquan2, LIU Ping2①, ZHANG Xiaohui1,2, ZHANG Jie1,2, YU Xuan2

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071)

A full-length cDNA sequence of F-ATPase β subunit gene from() was cloned by rapid amplification of cDNA ends (RACE). The sequence ofwas 1965 bp, containing a 571 bp 5' UTR, 341 bp 3' UTR, and a 1053 bp open reading frame (ORF) that encodes 350 amino acids polypeptides. The isoelectric point (p) was 4.86 and the molecular mass was 37.9 kDa. The amino acid sequence analysis demonstrated thatF-ATPaseβ has an F1-ATPaseβ domain, an AAA domain, and an ATP-synt-ab-C domain. Homology and phylogenetic analysis revealed that the amino acid sequence ofF-ATPaseβ shared a high similarity (89%) withand.mRNA level was detected in all tested tissues including the hepatopancreas, muscle, heart, gill, stomach, intestine, testis, and ovary. Thehad the highest level in the hepatopancreas and heart, and the lowest expression in the intestine. With the increase of inbreeding coefficient,expression decreased significantly in the hepatopancreas and heart (<0.05). The ATP synthase activity in the heart began to fall from F6generation and was significantly lower than F0generation (<0.05), but there was no significant change in the hepatopancreas. The results illustrate that inbreeding gradually reduces the expression ofand the ATP synthase activity in.

;; Gene cloning; Expression analysis; Inbreeding

LIU Ping, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

2016-11-28,

2016-12-27

S917.4

A

2095-9869(2018)01-0097-10

10.11758/yykxjz.20161128001

http://www.yykxjz.cn/

* 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(41576147)、泰山領(lǐng)軍人才工程高效生態(tài)農(nóng)業(yè)創(chuàng)新類計(jì)劃項(xiàng)目(LJNY2015002)和中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(20603022015016)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (41576147), the Program of Shandong Leading Talent (LJNY2015002), and the Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes (20603022015016)]. 王竹青, E-mail: leon19910215@outlook.com

劉 萍, 研究員, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

王竹青, 任憲云, 高保全, 劉萍, 張小輝, 張杰, 于旋. 三疣梭子蟹F型ATP酶β亞基()基因的克隆、組織表達(dá)及在家系近交中的變化. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(1): 97–106

Wang ZQ, Ren XY, Gao BQ, Liu P, Zhang XH, Zhang J, Yu X. cDNA cloning and expression analysis ofsubunit gene inand its variation in family inbreeding. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(1): 97–106