高靜水壓下益氣活血湯通過p38MAPK信號通路對兔椎體終板軟骨細胞的調控作用

柳根哲,孫　旗，陳　江,趙丁巖,祝永剛

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.北京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，北京 100700)

椎間盤退變性疾病是嚴重危害人類健康的多因素、復雜性疾病，其中終板軟骨鈣化退變參與了椎間盤的退變過程[1]。終板軟骨細胞在機械性因素和生物性因素的共同作用下引發(fā)相關基因表達變化，誘導終板軟骨細胞凋亡，打破細胞外基質合成和降解平衡，終板軟骨作為椎間盤營養(yǎng)通道的功能衰減，進而引發(fā)椎間盤退變[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號通路廣泛參與細胞凋亡、增殖、分化以及炎癥反應等生理病理過程[3]，據(jù)此推測p38MAPK信號通路可能參與終板軟骨鈣化退變的過程。益氣活血湯具有消補并用、益氣活血的功效，能有效減緩腰椎間盤退變，但目前尚未完全探明其確切作用機制。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在靜水壓作用下兔椎體終板軟骨細胞基因表達呈現(xiàn)“負荷-時間”依賴關系，長時間高壓作用可破壞細胞基質動態(tài)平衡，推測其可能與細胞內信號系統(tǒng)在細胞水平上負反饋機制的鈍化相關，為進一步探索修復椎體終板軟骨、預防椎間盤退變提供了新思路[4]。本研究擬通過觀察益氣活血湯含藥血清對持續(xù)高靜水壓下兔終板軟骨細胞p38MAPK信號通路的調控作用，探討益氣活血湯治療椎間盤退行性病變可能的作用機制，為椎間盤退變性疾病的治療提供新的切入點。

1　實驗資料

1.1實驗動物清潔級3月齡新西蘭兔20只，雌雄各半，體質量1.5～2.0 kg，用于制備血清；4周齡清潔級新西蘭兔6只(北京市動物實驗中心)，用于終板軟骨細胞體外傳代培養(yǎng)的取材。中國中醫(yī)科學院實驗動物中心提供清潔級醫(yī)學實驗動物環(huán)境設施。

1.2藥物益氣活血湯由黃芪、三七、當歸、白術、熟地、黨參、云苓、白芍、陳皮、川芎、甘草組成，由北京中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供。

1.3實驗試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibico公司)；胰蛋白酶、I型膠原酶(Sigma公司)；蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒(賽諾博)；磷酸化p38兔多抗、p38兔多抗(CST)；山羊抗兔IgG、GAPDH鼠單抗(天德悅)；靜水壓加載系統(tǒng)(北京世紀森朗實驗儀器有限公司)；Fresco低溫冷凍離心機、MultiSkan3酶標儀(Thermo)；濕轉電泳槽、電泳儀(Cavoy)；水平脫色搖床(其林貝爾)；酸度計 pH211(Hanna)；電動組織勻漿器(Fluka)。

1.4實驗方法

1.4.1益氣活血湯含藥血清的制備將20只清潔級3月齡新西蘭兔隨機分為含藥血清組和空白血清組，每組10只。根據(jù)人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表換算，新西蘭兔給藥劑量=臨床常用量×動物等效劑量系數(shù)(按體表面積)×培養(yǎng)基內稀釋度[5]。含藥血清組給予益氣活血湯11.6 g/(kg·d)灌胃，空白血清組給予同體積生理鹽水灌胃，上午、下午各1次，2組均連續(xù)灌胃7 d，于末次灌胃后2 h腹主動脈采血，靜置于4 ℃冰箱4 h后，2 500 r/min離心25 min，分離血清，同組血清混合，于56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾器過濾，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2終板軟骨細胞體外培養(yǎng)靜水壓加載干預模型的建立從3周齡清潔級新西蘭兔椎間盤中分離得到終板軟骨細胞，進行細胞培養(yǎng)至第3代終板軟骨細胞。將體外培養(yǎng)的第3代軟骨細胞和培養(yǎng)基裝入20 mL塑料注射器中，然后放入體外單層細胞靜水壓加載系統(tǒng)(具有加壓方便、操作安全的特點，其不僅具有普通液態(tài)加載裝置的優(yōu)點，還可以在維持細胞加壓環(huán)境中藥物濃度、離子組成、滲透壓不變的條件下，根據(jù)實驗需要自由改變靜水壓，同時還可以模擬正常人體椎間盤內的低氧及恒溫環(huán)境，見圖1)的壓力罐中，根據(jù)實驗需要施加不同的靜水壓，維持壓力罐溫度在37 ℃。

圖1　靜水壓裝置示意圖及細胞加載方式

1.4.3確定高靜水壓加載干預下益氣活血湯含藥血清對終板軟骨細胞最佳量效關系將第3代終板軟骨細胞隨機分為5組：正常組無任何干預；模型組不加益氣活血湯含藥血清，放入壓力罐中，施加1MPa靜水壓培養(yǎng)24 h；3個含藥血清組分別用濃度為0.5，1，2 μg/μL益氣活血湯含藥血清干預終板軟骨細胞，然后放入壓力罐中，施加1 MPa靜水壓培養(yǎng)24 h。每組每個時間段設6個復孔，做好標記及記錄，培養(yǎng)24 h后運用MTT法檢測各組終板軟骨細胞的增殖率，確定在高靜水壓加載下益氣活血湯含藥血清干預終板軟骨細胞的最佳量效關系。

1.4.4Western Blot法檢測終板軟骨細胞磷酸化p38、p38蛋白表達水平將第3代軟骨細胞按抽簽法隨機分為空白組、模型組、益氣活血湯含藥血清組，1 MPa靜水壓及1 μg/μL益氣活血湯含藥血清干預24 h后，使用預冷RIPA蛋白抽提試劑提取終板軟骨細胞中總蛋白，加入蛋白酶抑制劑，BCA 法測定蛋白含量，RIPA調整蛋白濃度，Western Blot 法檢測蛋白表達量，待檢測蛋白樣品上樣量10 μg/孔，設置合適的電泳條件，濕轉法轉膜，轉膜完成后麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉膜效果。將膜完全浸沒3% BSA-TBST中室溫輕搖30 min，加入一抗：磷酸化p38 1∶4 000， p38 1∶1 000。4 ℃過夜，第2天TBST洗膜5次，每次3 min，結合二抗山羊抗兔IgG(H+L)HRP，1∶20 000，室溫輕搖40 min， TBST洗膜6次，每次3 min，ECL化學發(fā)光檢測，顯影2 min后定影。內參蛋白GAPDH檢測：一抗選用GAPDH鼠單抗，二抗為山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP，1∶10 000，實驗步驟同磷酸化p38、p38蛋白表達檢測方法。

2　結　　果

2.1終板軟骨細胞的形態(tài)及鑒定原代軟骨終板細胞呈球形懸浮狀態(tài)，具有強折光性，培養(yǎng)24 h后逐漸貼壁伸展，細胞形態(tài)以三角形、多角形為主，核為圓形或橢圓形，胞漿豐富，內含分泌顆粒。在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1周后，在倒置相差顯微鏡下觀察到細胞間開始有突起連接，周圍有基質樣物質沉積，細胞呈單層生長狀態(tài)，逐漸鋪滿培養(yǎng)瓶，2周后終板軟骨細胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶。第3代軟骨終板細胞增殖速度較快，細胞生長成熟，形狀開始出現(xiàn)長梭形，故選用第3代終板軟骨細胞進行研究。 甲苯胺藍染色可以觀察到正常終板軟骨細胞胞漿呈藍色，可見1～2個核仁，呈藍紫色。正常終板軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組化染色呈陽性反應，細胞胞漿內有棕黃色顆粒，胞核基本無著色。見圖2及圖3。

圖2　倒置相差顯微鏡下終板軟骨細胞形態(tài)

圖3　第3代終板軟骨細胞甲苯胺藍染色及免疫組化染色

2.2最佳益氣活血湯含藥血清干預濃度正常組MTT法測定細胞增殖率(OD490)為0.472±0.023，模型組為0.218±0.023，0.5 μg/μL含藥血清組為0.338±0.019，1 μg/μL含藥血清組為0.458±0.017，2 μg/μL含藥血清組為0.357±0.024。模型組終板軟骨細胞增殖率明顯低于正常組(P<0.05)；0.5，1，2 μg/μL含藥血清在靜水壓干預下均能促進軟骨細胞增殖，其中1 μg/μL含藥血清組終板軟骨細胞增殖率明顯高于模型組(P<0.05)，故選擇以1 μg/μL濃度的益氣活血湯含藥血清作為后續(xù)實驗的最佳含藥血清干預濃度。

2.3終板軟骨細胞中磷酸化p38、p38蛋白表達情況各組均可見磷酸化p38、p38蛋白的表達，各組p38蛋白表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。正常組磷酸化p38微弱表達，模型組磷酸化p38蛋白表達量明顯高于正常組(P<0.05)，而含藥血清組磷酸化p38蛋白表達量明顯低于模型組(P<0.05)。見圖4及表1。

3　討　　論

椎間盤退變是人體自然衰老的過程之一。近年研究證實，終板軟骨鈣化退變所致的營養(yǎng)代謝及物質轉運功能的衰減是椎間盤退變的始動因素和關鍵環(huán)節(jié)[6]，終板軟骨是供應椎間盤營養(yǎng)的主要通道，一旦終板軟骨出現(xiàn)鈣化退變，椎間盤的營養(yǎng)供應就會出現(xiàn)障礙，從而導致椎間盤退變。終板軟骨細胞是終板軟骨內唯一細胞成分，其功能減退可引起終板軟骨的功能障礙[7-8]。本課題組前期研究證實靜水壓大小及作用時間可以顯著影響終板軟骨細胞基因的表達，椎體終板軟骨細胞在高靜水壓(1 MPa)下培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)細胞基質合成基因和抗分解代謝基因表達下降，同時炎癥反應相關基因及細胞基質分解代謝基因表達提高，提示高壓持久作用對基質動態(tài)平衡產生不利影響，細胞外基質代謝紊亂可引起椎體終板功能受損，從而誘發(fā)椎間盤退行性病變[4]。p38MAPK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)介導的信號轉導通路的重要分支，在細胞凋亡、炎癥反應、細胞周期和生長等多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[9]。

圖4　各組終板軟骨細胞中磷酸化p38、p38蛋白表達情況

表1　各組終板軟骨細胞中磷酸化p38、p38蛋白表達量比較

注：①與模型組比較，P<0.05。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學認為椎間盤退變病機為體姿失當，氣血失調，日久累積致氣虛血瘀，治當以調理氣血、益氣活血為法。益氣活血方消補并用，補氣而不壅滯，攻伐而不傷正，破中有補，補中有行，可以顯著抑制炎癥反應，減少炎性因子的生成，有效抑制椎間盤細胞凋亡，促進椎間盤細胞增殖，進而延緩椎間盤的退變[10]。本研究通過體外實驗觀察了益氣活血湯含藥血清對持續(xù)性高靜水壓干預的終板軟骨細胞的作用，結果發(fā)現(xiàn)終板軟骨細胞在單純高靜水壓作用24 h后，細胞增殖能力受到明顯抑制，細胞凋亡數(shù)量增加；同時各濃度益氣活血湯含藥血清組在持續(xù)高靜水壓刺激24 h后均有促進終板軟骨細胞增殖的作用，其中以1 μg/μL濃度的益氣活血湯含藥血清促細胞增殖作用最明顯。證實益氣活血湯含藥血清對高靜水壓誘導的終板軟骨細胞凋亡具有保護作用，可明顯促進終板軟骨細胞增殖。

既往研究發(fā)現(xiàn)，在機械應力、滲透壓變化、氧化反應等因素刺激下即可引起p38MAPK磷酸化，磷酸化的p38MAPK隨即轉位到細胞核，激活轉錄因子，啟動相關基因的表達，進而影響細胞因子生成，參與細胞增殖、調控細胞凋亡等生理病理過程，與椎間盤退行性病變的病理過程密切相關[11]。Ariga等[12]研究發(fā)現(xiàn)隨著外在壓力的增高，體外培養(yǎng)的終板軟骨細胞增殖能力下降，細胞凋亡增加，p38MAPK信號通路可能發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。本研究結果顯示，正常組磷酸化p38表達微弱，高靜水壓刺激24 h后，磷酸化p38蛋白表達顯著升高，而益氣活血湯含藥血清能顯著下調磷酸化p38表達，因此推測益氣活血湯可能通過調控p38MAPK信號通路的激活發(fā)揮保護終板軟骨細胞的作用。

綜上所述，持續(xù)高靜水壓刺激可以顯著降低終板軟骨細胞增殖率，促進磷酸化p38蛋白表達，而益氣活血含藥血清能顯著抑制上述作用，推測益氣活血湯可能通過介導p38MAPK信號通路的激活，參與了持續(xù)高靜水壓誘導的兔終板軟骨細胞凋亡的信號轉導，可能有助于阻止終板軟骨的退變，為揭示其治療椎間盤退變性疾病的作用機制了提供新的研究思路，對指導椎間盤退變性疾病的防治具有重要意義。但由于體外實驗環(huán)境單一，不能夠完全模擬體內復雜的細胞因子表達變化和細胞因子具體的信號傳導通路，故還需構建相關動物模型進行體內實驗；另外，p38MAPK信號通路包括上游信號因子及下游效應因子，其具體所涉及的細胞因子還需要進一步研究。

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