DNA倍體分析和HPV E6/E7檢測診斷宮頸ASCUS的價值

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(1.青島大學(xué)附屬威海市立第二醫(yī)院病理科；2.理療科；3.兒童保健科 山東 威海 264200)

宮頸癌的發(fā)病率是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第一位，而我國宮頸癌的患者數(shù)約占世界的1/3以上，其中每年因?qū)m頸癌導(dǎo)致死亡的人數(shù)達(dá)5萬人，且宮頸癌人群日趨年輕化。因此臨床上對宮頸癌的早期篩查顯得尤為重要。未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)作為伯塞斯達(dá)系統(tǒng)(the Bethesda system，TBS)分類法異常結(jié)果報告中最常見的細(xì)胞學(xué)異常，其在病理組織學(xué)上具有診斷及分類的多樣性。據(jù)估計ASCUS 婦女中有5%～10%隱匿有嚴(yán)重的宮頸癌前病變[1-2]，且治療不及時往往可以發(fā)展成為宮頸癌。故有關(guān)ASCUS的處理是臨床宮頸病變診治的爭論點(diǎn)，且有關(guān)其分流處理一直以來是宮頸病變診治中存在的難點(diǎn)。目前宮頸疾病最常用的篩查方法是宮頸細(xì)胞學(xué)檢查及人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)檢測，但令人遺憾的是無論是傳統(tǒng)的巴氏涂片還是薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查(thinprep cytologic examination，TCT)，單一的宮頸細(xì)胞學(xué)檢查對于宮頸癌前病變及宮頸癌篩查來說，其敏感性均較低[3]。盡管HPV DNA檢測可早期發(fā)現(xiàn)HPV感染，但HPV感染大多是一過性的，因此其檢測的敏感性并不高。本研究選取980例ASCUS患者，進(jìn)行DNA倍體分析聯(lián)合HPV E6/E7mRNA檢測，探究兩者對診斷宮頸ASCUS的價值。

1對象和方法

1.1研究對象

選取2015年1月至2017年3月在青島大學(xué)附屬威海市立第二醫(yī)院婦科門診及住院部就診的TCT結(jié)果為ASCUS的患者980例。平均年齡為38.9(20～66)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠，未婚，子宮切除手術(shù)史或?qū)m頸手術(shù)史，在行化療或曾經(jīng)行過化療及盆腔放療者，取標(biāo)本前3天內(nèi)有陰道沖洗放藥或性生活史。本研究中所有受檢者均知情同意并簽署同意書，本研究獲得青島大學(xué)附屬威海市立第二醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集及TCT檢測

所有受試檢者統(tǒng)一由一位有經(jīng)驗(yàn)的婦科醫(yī)師于經(jīng)期結(jié)束3～10天內(nèi)以窺陰器暴露子宮頸后擦凈子宮頸口分泌物，采用TCT專用刷在宮頸口順時針旋轉(zhuǎn)3圈，停留10s取材，標(biāo)本放入TCT專用保存管保存行TCT常規(guī)檢測，剩余標(biāo)本于-25℃下保存。診斷標(biāo)準(zhǔn)依照癌癥協(xié)會推薦的TBS分類標(biāo)準(zhǔn)，其結(jié)果描述為：高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSILs)；低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSILs)；不排除高度上皮內(nèi)病變的不典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamouscells-cannot exclude HIS，ASC-H)；ASCUS；未見上皮內(nèi)病變或惡性病變(No intraepithelial lesions or malignant lesions，NILM)。

1.2.2細(xì)胞DNA倍體分析

采用DNA-ICM系統(tǒng)對細(xì)胞進(jìn)行掃描分析，以細(xì)胞核DNA指數(shù)(DI)為判讀標(biāo)準(zhǔn)[(DI=全部被測細(xì)胞的DNAIOD值/正常細(xì)胞DNA(Go/G1)的IOD平均值)]，其中異常倍體細(xì)胞包括DI≥2.5為異倍體細(xì)胞、非整倍體細(xì)胞或4倍體細(xì)胞增加≥10%、出現(xiàn)非整倍體細(xì)胞峰。而DI：2.2～2.5為非整倍體細(xì)胞；DI：1.2～1.8為出現(xiàn)非整倍體細(xì)胞。0.8≤DI<1.2為2倍體細(xì)胞即2c細(xì)胞，1.8≤DI<2.2為4倍體細(xì)胞即4c細(xì)胞。本研究主要檢測DI>1.25的細(xì)胞，包括非整倍體細(xì)胞、4c細(xì)胞、異倍體細(xì)胞。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA檢測

采用科蒂亞生物技術(shù)有限公司的Quanti VirusTM診斷試劑盒及Quanti VirusTM冷光儀進(jìn)行E6/E7 mRNA表達(dá)的檢測。將檢測結(jié)果通過計算機(jī)轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，以拷貝數(shù)≥1copies/mL為陽性,<1copy/mL為陰性。

1.2.4陰道鏡及病理學(xué)檢查

對部分細(xì)胞學(xué)和(或)DNA倍體異常和(或)HPV E6/E7 mRNA檢測陽性的婦女于陰道鏡下行宮頸活組織檢查。其病理學(xué)檢查結(jié)果包括：宮頸癌、宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變(CIN1、CIN2、CIN3/CIS)及正?；蛄夹?。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0，率的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。以P<0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1 DNA倍體分析及組織病理學(xué)結(jié)果

980例經(jīng)陰道鏡下宮頸活檢的ASCUS患者，CINⅠ及以上病變者458例。DNA倍體正常者369例，其中組織病理學(xué)診斷為CIN Ⅰ及以上病變者168例(45.5%)；伴1～3個DNA異倍體細(xì)胞者143例，CINⅠ及以上病變者38例(26.6%)；有>3個DNA異倍體細(xì)胞者468例， CIN Ⅰ及以上病變者216例(46.1%)。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與DNA正常組相比，ASCUS伴DNA異倍體1～3個組發(fā)生CIN Ⅰ及以上病變者顯著降低(χ12=15.399，P1=0.000)；而ASCUS伴DNA異倍體1～3個組發(fā)生CIN Ⅰ及以上病變者低于SCUS伴DNA異倍體>3個組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ32=17.288，P3=0.000)，見表1。DNA倍體分析檢測結(jié)果的靈敏度為84.1%，特異性為43.4%。

表1 980例ASCUS患者DNA倍體分析與宮頸病變之間的關(guān)系[n(%)]Table 1 Relationship between DNA ploidy analysis and cervical lesions in 980 patients with ASCUS[n (%)]

注：χ12、P1表示ASCUS伴DNA異倍體1～3個與DNA正常組相比；χ22、P2表示ASCUS伴DNA異倍體>3個與DNA正常組相比；χ32、P3表示ASCUS伴DNA異倍體1～3個與ASCUS伴DNA異倍體>3個相比。

2.2 HPV E6/E7 mRNA表達(dá)及病理檢查結(jié)果

各組間的HPV E6/E7 mRNA陽性率有差異，其中CINⅠ及以上的HPV E6/E7 mRNA陽性率顯著高于正?；蛄夹越M，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為13.221，35.302，23.894，18.439，均P=0.000)，詳見表2。HPV E6/E7mRNA表達(dá)檢查結(jié)果的靈敏度為90.3%，特異性為49.6%。

2.3 DNA倍體分析聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA

DNA倍體分析聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA對CINⅡ及以上病變的檢測結(jié)果的靈敏度為92.4%，特異性為32.7%，陽性預(yù)測值為41.0%，陰性預(yù)測值為89.5%，見表3。

表2 ASCUS患者HPV E6/E7 mRNA表達(dá)與宮頸病變之間的關(guān)系[n(%)]Table 2 Relationship between HPV E6/E7 mRNA expression and cervical lesions in ASCUS patients[n (%)]

注：χ12、P1表示CINⅠ與正?；蛄夹韵啾?χ22、P2表示CINⅡ與正?；蛄夹韵啾?χ32、P3表示CINⅢ與正?；蛄夹韵啾?，χ42、P4表示宮頸癌與正?；蛄夹韵啾取?/p>

表3 DNA倍體分析聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA對CINⅡ及以上病變的檢測結(jié)果[n(%)]Table 3 Detection results of DNA ploidy analysis combined with HPV E6/E7 mRNA for CIN II and above lesions[n (%)]

3討論

目前推薦的有關(guān)宮頸癌的診斷是三階梯的診斷程序，即細(xì)胞學(xué)-陰道鏡-病理學(xué)。其中得益于細(xì)胞學(xué)檢查的推廣，近幾十年來宮頸癌的發(fā)生率在全世界范圍內(nèi)都表現(xiàn)一個下降的趨勢。盡管如此，但其特異性、敏感性及假陰性率都會使得可疑患者遭受不必要的痛苦。而且并非所有的癌前病變都會進(jìn)展為浸潤癌，國內(nèi)學(xué)者研究顯示低級別的病變可維持不變或自動逆轉(zhuǎn)，僅約1/3未經(jīng)治療的高級別病變可能會在10年內(nèi)發(fā)展成癌[4]。而ASCUS這一術(shù)語，它不僅包括與HPV 感染無關(guān)的宮頸上皮的良性改變，而且包括與HPV 感染密切相關(guān)的CIN 及宮頸癌，即細(xì)胞學(xué)報告為ASCUS時，其陰道鏡下活檢結(jié)果可以是正常宮頸，也可以是早期浸潤癌[5],227例TCT結(jié)果為ASCUS患者中CIN的發(fā)生率為29.96%，其中高級別的CIN(CIN2和CIN3)的發(fā)生率為13.22%，組織病理結(jié)果為炎癥的占70.04%。研究表明，ASCUS可能是發(fā)現(xiàn)高級別CIN的最早的信號[6-7]。目前，對ASCUS 的處理尚未形成統(tǒng)一的認(rèn)識，推薦有三種處理方法:①立即行陰道鏡下活檢檢查；②細(xì)胞涂片隨訪觀察；③HPV檢測。但對所有病例進(jìn)行活不但會增加患者的負(fù)擔(dān)與痛苦，而且也加大醫(yī)師工作量；細(xì)胞學(xué)涂片隨訪又敏感性差且隨訪時間長；HPV檢測可能導(dǎo)致漏診。因此將DNA倍體分析、HPV E6/E7 mRNA與ASCUS病例結(jié)合，探索分流ASCUS患者的最佳方案。

3.1 DNA倍體分析與宮頸活檢結(jié)果相比

細(xì)胞發(fā)生癌變時其細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)構(gòu)和含量會產(chǎn)生異常變化，導(dǎo)致DNA倍體狀況發(fā)生改變，出現(xiàn)DNA異倍體細(xì)胞[8]。本研究在DNA倍體分析中發(fā)現(xiàn)，與DNA正常組相比，ASCUS伴DNA異倍體1～3個組發(fā)生CIN Ⅰ及以上病變者顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P1=0.000)；而ASCUS伴DNA異倍體1～3個組發(fā)生CIN Ⅰ及以上病變者低于SCUS伴DNA異倍體>3個組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P3=0.000)，這與國內(nèi)其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致[9]。而國外學(xué)者所進(jìn)行的回顧性研究結(jié)果認(rèn)為對HR-HPV和DNA倍體分析均為陰性的患者，CINⅠ及以上病變可以1年后隨訪；而對于異倍體細(xì)胞為>5c細(xì)胞的患者則必須再次行細(xì)胞學(xué)檢查和(或)陰道鏡檢查[10]。因此，建議經(jīng)TCT診斷為ASCUS患者可行DAN倍體分析，若DNA倍體正?；?yàn)?～3個的患者可定隨訪或先行HPV檢測，無需活檢。但對于DNA倍體>3個者應(yīng)立即行宮頸活檢。

3.2 HPV E6/E7 mRNA與宮頸活檢結(jié)果相比

HPV感染作為宮頸癌發(fā)生的主要危險因素，幾乎所有的高級別CIN及宮頸癌都合并有HPV感染[11]。227例宮頸ASCUS患者中，HPV陽性組CIN的檢出率高于HPV陰性組[6]。因此近年來，人們試圖將HPV DNA檢測用于ASCUS的分流處理。但HPV DNA檢測存在一定的局限性，如不能區(qū)分宮頸進(jìn)行性發(fā)展的HPV感染、退行性HPV感染及持續(xù)性HPV感染，且在凋亡細(xì)胞及細(xì)胞碎屑中也會出現(xiàn)陽性結(jié)果從而增加患者對宮頸癌的精神心理負(fù)擔(dān)，甚至使得患者接受了過度治療[12]。宮頸上皮細(xì)胞感染HR-HPV后，病毒癌基因,即HPV早期編碼區(qū)中E6、E7基因的mRNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄，生成兩種癌蛋白E6、E7蛋白。E6、E7蛋白可與宿主細(xì)胞的抑癌基因p53和Rb蛋白等相結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期的失常，進(jìn)而使得宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致癌變的發(fā)生[13-14]。因此HPV E6/E7 mRNA的檢測能在宮頸組織中表現(xiàn)出癌基因活性[15]。對HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行檢測不僅排除可疑或低度病變的能力強(qiáng)，而且對ASCUS患者的高級別病變具有較高辨別能力，能更好地篩選出高危人群，為臨床醫(yī)生提供比DNA檢測更具有預(yù)測價值的檢測結(jié)果[16]。故HPV E6/E7 mRNA檢測應(yīng)作為重點(diǎn)研究對象于2006年歐洲生殖器感染和腫瘤研究組織中取得共識[17]。因此，本研究采用HPV E6/E7 mRNA檢測對ASCUS進(jìn)行分流，結(jié)果顯示CINⅠ及以上的HPV E6/E7 mRNA陽性率顯著高于正?；蛄夹越M，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這與國外學(xué)者Bello等[14]的結(jié)論相一致，他們研究發(fā)現(xiàn)對于高級別CIN，HPV E6/E7 mRNA檢測具有有更好的特異性。但國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA檢測較HR-HPV DNA檢測具有更高的特異性，但它們之間在CIN Ⅰ及以上級別的靈敏度上差異無統(tǒng)計學(xué)[18]。國內(nèi)學(xué)者王華等[19]研究顯示，宮頸病變程度越高，HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)水平也越高，細(xì)胞學(xué)病變級別不同其CIN的mRNA表達(dá)也存在統(tǒng)計學(xué)差異。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)對于CIN Ⅰ以下的病變者，HPV E6/E7 mRNA的陽性率低于CIN Ⅰ及以上病變者，因此認(rèn)為HPV E6/E7 mRNA檢測對于鑒別宮頸病變是短暫的宮頸異常還是將進(jìn)一步發(fā)展有很大意義。

3.3細(xì)胞DNA倍體分析聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA與宮頸活檢結(jié)果相比

本研究發(fā)現(xiàn)DNA倍體分析聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA對CINⅡ及以上病變檢測結(jié)果的靈敏度為92.4%，特異性為32.7%。與兩者單獨(dú)檢測相比較，兩者聯(lián)合的靈敏度有所提高。該理論尚需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上所述，對于ASCUS患者，臨床醫(yī)師需采取更為有效的檢測方案用于ASCUS的分流處理，從而為避免對低風(fēng)險人群的過度檢查和治療。其中DNA倍體分析及HPV E6/E7 mRNA的檢測可協(xié)助臨床醫(yī)師減少對ASCUS患者的漏診，同時也能避免給患者帶來過度的檢查及治療，減少患者的痛苦及精神負(fù)擔(dān)。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳]