室旁核內(nèi)脂肪酸酰胺水解酶上調(diào)介導(dǎo)慢性心衰大鼠交感神經(jīng)興奮亢進(jìn)*

王仁俊，周　琴，未曉巍，李　華，趙永斌，齊云峰，欒　劍，周曉馥

(吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，吉林 四平 136000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)的臨床病理特征之一為交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)[1]。CHF狀態(tài)下中樞神經(jīng)系統(tǒng)中相關(guān)作用機(jī)制改變可導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，研究報(bào)道顯示CHF狀態(tài)下交感活動(dòng)亢進(jìn)是下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)、微小核苷酸或離子通道等內(nèi)源性物質(zhì)整合作用失衡的結(jié)果[2-3]，但PVN內(nèi)的大麻素類物質(zhì)是否參與了CHF交感神經(jīng)激活作用，迄今為止，未見相關(guān)報(bào)道。

N-花生四烯酰乙醇胺(N-arachidonoylethanolamide，AEA)是一種內(nèi)源性大麻素樣物質(zhì)，首次發(fā)現(xiàn)AEA合成是在神經(jīng)元中。研究顯示多種類型的神經(jīng)遞質(zhì)是以儲(chǔ)存的形式釋放，但AEA的釋放方式卻是“按需求”合成，其分布位置主要集中在內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌、心肌及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等[4]，已有研究顯示AEA的酶降解過程主要為脂肪酸酰胺水解酶(fatty-acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH)途徑，F(xiàn)AAH在腦中含量高，且能有效水解AEA[5]。在大腦半球中注入FAAH抑制劑PF3845可降低FAAH活性，增加AEA在腦組織中的含量[6-7]，即在大腦皮層中AEA含量及FAAH表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。另有文獻(xiàn)報(bào)道，AEA在抗心肌缺血和抗心律失常等諸多方面發(fā)揮重要的保護(hù)作用。另外，在肺動(dòng)脈中的AEA具有擴(kuò)血管并降低血壓的作用[8]；在右心房注射AEA可較大程度地增強(qiáng)肺迷走傳入神經(jīng)的敏感性[9]，以上研究結(jié)果提示AEA在外周對心血管起保護(hù)作用。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，增加終紋核中內(nèi)源性的AEA水平，可有效抑制心動(dòng)過速[10]； 此外，在海馬區(qū)中AEA能夠增強(qiáng)N-甲基-D-天冬氨酸受體調(diào)控的電流[11]，N-甲基-D-天冬氨酸受體激活能促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，引起心肌收縮；將AEA注射到中腦導(dǎo)管周圍灰質(zhì)中，可誘導(dǎo)產(chǎn)生一定量的一氧化氮[12]，一氧化氮具有擴(kuò)張血管的作用，進(jìn)而降低動(dòng)脈血壓；孤束核中微量注射AEA能夠延長壓力反射時(shí)間，從而抑制交感神經(jīng)活性[13]；在麻醉大鼠PVN內(nèi)注射AEA可明顯降低動(dòng)脈血壓[14]。這些均提示AEA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與了交感興奮調(diào)節(jié)及血壓反射調(diào)控。但在PVN內(nèi)FAAH和AEA是否參與CHF狀態(tài)下的交感神經(jīng)興奮激活過程，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本文擬用實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證PVN內(nèi)上調(diào)的FAAH通過抑制AEA的生成介導(dǎo)CHF狀態(tài)下交感神經(jīng)興奮亢進(jìn)作用這一假說。

材　料　和　方　法

1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：SCXK(吉)2011-0004?；A(chǔ)飼料由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2010-0001。動(dòng)物生活環(huán)境恒溫(23±2) ℃，常規(guī)24 h晝夜循環(huán)。

2　藥品、試劑與實(shí)驗(yàn)設(shè)備

AEA和PF3845等藥品和試劑購自長春鼎國生物技術(shù)有限公司。重組2型腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-assciated virus type 2，rAVV2)購自山東維真生物科技有限公司。腦立體定位儀(NARISHIGE,SR-5M-HT)；多通道生理信號(hào)采集系統(tǒng)(成都泰盟有限公司)；激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(ZEISS，LSM 710)等。

3　方法

3.1CHF模型的構(gòu)建取Wistar大鼠，麻醉固定后，分離氣管，連接呼吸機(jī)，于3～4肋骨間打開胸腔，使其心臟暴露后，小心剪開心包膜，CHF組大鼠用0號(hào)帶線縫合針結(jié)扎其左冠狀動(dòng)脈，假手術(shù)組僅穿線，不結(jié)扎，手術(shù)縫合。術(shù)后注射青霉素抗感染，每天1次，連用3天，常規(guī)飼養(yǎng)8周后行急性實(shí)驗(yàn)。

3.2監(jiān)測大鼠超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)用30%烏拉坦及α-氯醛糖腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用心臟超聲心動(dòng)圖儀檢測左心室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)和左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventri-cular end-diastolic diameter，LVEDD)等。先后分離股動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈并插管，通過壓力換能器連接多道生理記錄儀，采集平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)和左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，俯臥固定麻醉大鼠，分離腎交感神經(jīng)，記錄腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)(renal sympathetic nerve activity，RSNA)和標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，并同步測量心率(heart rate，HR)。

3.3PVN微量注射AEA或PF3845參照Paxinos & Watson大鼠腦圖譜，將麻醉大鼠固定于腦立體定位儀上，于下丘腦PVN(前囟后1.7 mm，L和R均為 0.5 mm，H為7.2 mm)微量注射PF3845(0.5、1和2 nmol/200 nL，溶劑為含1%二甲亞砜的生理鹽水)或AEA(2、4和8 nmol/200 nL,溶劑為含0.01% Tocrisolve 100的人工腦脊液，Tocrisolve 100為豆油和水按1∶4比例形成的水溶性乳狀液，其乳化劑為Pluronic F-68)，注射速度為5 μL/h，注射時(shí)間1 h，PVN雙側(cè)注射，每側(cè)注射100 nL，實(shí)時(shí)監(jiān)測MAP、HR和RSNA等指標(biāo)。

3.4靜脈注射AEA將麻醉大鼠仰臥固定，于其股靜脈注射不同濃度的AEA(4、8和16 nmol/0.1 mL)，實(shí)時(shí)監(jiān)測MAP、HR和RSNA等指標(biāo)。

3.5攜帶FAAHshRNA的rAAV2載體的構(gòu)建針對GeneBank中大鼠FAAH基因序列(NM 024132.3)，按照RNA干擾的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出可靶向干擾大鼠FAAH基因轉(zhuǎn)錄的特異性片段，具體序列為5’-TTGCTGACCCTGCCCCTACTCCAACTGGT-3’，同時(shí)設(shè)計(jì)其能編碼shRNA的DNA鏈(表1)，其中包含一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)及BamH I 和EcoR I的雙酶切位點(diǎn)，使用BamH I 和EcoR I酶雙酶切 pSIREN載體，使其線性化，再將目的基因片段與線性化的pSIREN載體進(jìn)行連接，在連接反應(yīng)體系中其退火的雙鏈DNA(表2)，連接成功后將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞中，選擇轉(zhuǎn)化成功的感受態(tài)陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV2，篩選出第1代毒種并進(jìn)行毒種擴(kuò)增，即攜帶FAAHshRNA的rAAV2載體的擴(kuò)增。

表1　構(gòu)建FAAH shRNA寡核苷酸框架Table 1.Building a framework for FAAH shRNA oligonucleotides

表2　構(gòu)建退火雙鏈DNA寡核苷酸框架Table .Building a framework of the annealing double-stranded DNA oligonucleotides

3.6PVN內(nèi)轉(zhuǎn)染FAAHshRNA病毒敲減PVN內(nèi)FAAH基因?qū)⒋笫笾糜诤惙榈恼T導(dǎo)盒內(nèi)氣體麻醉，待麻醉成功后將其俯臥固定于立體定位儀，帶上呼吸面罩，以維持手術(shù)過程中麻醉，頭部剃毛消毒后，于體式顯微鏡下，參照大鼠腦立體定位圖譜定位，消毒棉球擦拭去除頭骨表面結(jié)蹄組織及骨膜，用電鉆鉆出一個(gè)小孔，將微量注射器固定在操縱器上，以1 000 μm/min的速度進(jìn)入腦內(nèi)，總深度為7.2 mm。到達(dá)PVN后穩(wěn)定10 min，以0.1 μL/min的速度勻速注射事先制備的攜帶目的基因干擾序列的rAAV2-hSyn-FAAH-shRNA病毒(FAAH-shRNA組)和rAAV2-hSyn-scramble-WPRE-pA病毒(Sc-shRNA組)，PVN雙側(cè)注射總劑量為200 nL，單側(cè)注射100 nL，滴度為1×1017vg/L，注射完畢后靜置20 min，再以1 000 μm/min的速度退出。結(jié)束后，以骨蠟封閉小孔，碘伏消毒后縫合，術(shù)后肌肉注射青霉素1周抗感染。

3.7Western bolt實(shí)驗(yàn)檢測PVN內(nèi)FAAH的蛋白表達(dá)水平取實(shí)驗(yàn)大鼠PVN組織分別加入蛋白提取緩沖液(10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA、1% SDS、0.1% Triton X-100和1 mmol/L PMSF)，超聲粉碎，37 ℃孵育5 min；4 ℃、12 000 r/min離心8 min；上清液即為全細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度；分別在各組取等量的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，濾紙-膜-濾紙樣的三明治法電轉(zhuǎn)移至NC膜；用封閉液(含5%脫脂奶粉)室溫封閉過夜；I 抗4 ℃孵育過夜后，PBS洗滌3次，每次10 min，然后用辣根過氧化物酶熒光標(biāo)記的 II 抗分別對膜避光孵育1 h，再用PBS洗滌3次，每次10 min，然后用ECL固定，最后顯影定影，掃膜。

3.8高效液相色譜檢測PVN內(nèi)AEA的含量取冷凍的PVN組織精密稱量后，放入加有水解酶抑制劑PMSF的玻璃瓶中，加入乙腈溶劑20 mL，勻漿打碎后，進(jìn)行為時(shí)1 h的超聲。4 ℃靜置過夜，沉淀蛋白。將沉淀物全部放入離心機(jī)(10 000 r/min)離心10 min，收集上層有機(jī)相。利用固相萃取柱過濾收集的有機(jī)相，首先加入2 mL流動(dòng)相，然后使用乙酸乙酯∶丙酮(比例1∶1)共5 mL進(jìn)行洗脫，收集濾液，再用氮?dú)獯蹈上疵撘?。順著燒杯邊緣加? mL乙腈，再渦旋儀混合，復(fù)溶，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述處理得到的樣品，精密吸取0.5 mL乙腈樣品溶液于離心管，加入0.5 mL AEA衍生化試劑DBD-COCL，恒溫50 ℃反應(yīng) 2 h。加入100 μL去離子水終止反應(yīng)。進(jìn)樣高效液相色譜檢測分析。

3.9組織免疫熒光觀察心臟灌流，取腦，4%多聚甲醛固定，蔗糖梯度脫水，冰凍切片，切片厚約25 μm，取大鼠室旁核大腦切片和腰4背根神經(jīng)節(jié)(高表達(dá)FAAH)組織切片[作為陽性對照(positive control，PC)]，置于PBS中浸泡10 min，以去除OCT； 用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1 h； 加入兔抗大鼠FAAH I抗，陰性對照(negative control，NC)采用的I抗是兔IgG，濕盒4 ℃冰箱孵育過夜； PBS洗3次，每次15 min；加入紅色熒光標(biāo)記的山羊抗兔的IgG II 抗，濕盒4 ℃冰箱孵育過夜；PBS洗3次，每次10 min；中性樹脂封片后，用共聚焦掃描顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

3.10ELISA檢測血漿中去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)水平腹主動(dòng)脈采血法取各實(shí)驗(yàn)組大鼠動(dòng)脈血，在腹主動(dòng)脈分叉處向心端1～3 mm處穿刺并采血。4 ℃ 離心20 min，放置于-80 ℃冰箱待后續(xù)檢測，具體步驟按照NE水平ELISA檢測試劑盒說明書操作，通過酶標(biāo)儀讀取并分析數(shù)據(jù)。

3.11心臟組織病理學(xué)觀察抽取1%伊文氏藍(lán)2 mL推入腹腔靜脈，1 min后迅速剪下心臟,沖洗后沿心臟長軸通過心臟切片器橫切5～6片1 mm薄片，隨后置于含3% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑的培養(yǎng)皿中37 ℃孵育20 min。梗死面積(infarct size，IS；%)=梗死區(qū)面積/心臟切片的總面積×100%。該比值≥30%為冠脈結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)CHF模型成功標(biāo)志。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，采用單因素方差分析和Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較或采用Student’st檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　CHF模型成功建立

左冠脈結(jié)扎術(shù)后 8周，利用超聲心動(dòng)圖等技術(shù)對假手術(shù)組及CHF組大鼠各指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CHF組大鼠的LVEDP顯著升高，左心室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dt)和FS明顯下降(P<0.05)；CHF組大鼠的肺體比和心臟重量均明顯增加(P<0.05)，提示CHF大鼠有肺淤血等CHF跡象；CHF組大鼠心肌梗死面積明顯增加(P<0.05)，其心肌梗死面積在32%～41%之間，而假手術(shù)組大鼠并未出現(xiàn)心肌梗死的現(xiàn)象，見表3。以上結(jié)果均顯示CHF大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生顯著變化，CHF模型構(gòu)建成功。

2　PVN注射位點(diǎn)鑒定

藥物注射完畢后，向PVN中注入2%的滂恩天藍(lán)50 nL，腹腔注入過量烏拉坦處死大鼠，迅速取腦。于冰凍切片機(jī)切片，切片厚度約為40 μm，體式顯微鏡下觀察其注射位點(diǎn)，參照Paxinos & Watson大鼠腦圖譜，結(jié)果顯示核團(tuán)注射成功，見圖1。

表3CHF組與假手術(shù)組大鼠解剖學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)和交感驅(qū)動(dòng)生理學(xué)指標(biāo)檢測
Table 3.The indexes of anatomy,hemodynamics and sympathetic drive in the CHF rats and the sham rats (Mean±SEM.n=6)

IndexShamCHFBW(g)368±5394±6HW(g)1．40±0．031．67±0．07?RV/BW(mg/g)0．67±0．041．60±0．11?LW/BW(mg/g)6．23±0．2814．03±0．34?IS(%)039．3±3．0?LVEDV(mL)0．35±0．090．88±0．06?LVEDD(mm)6．31±0．219．83±0．31?FS(%)41．2±1．3127．7±1．38?EF(%)65．7±1．9838．4±2．11?LVSP(mmHg)121±4101±5?LVEDP(mmHg)3．61±0．0320．8±2．3?dp/dt(mmHg/s)7794±2394025±154?MAP(mmHg)99．3±3．792．6±4．0HR(min-1)376．4±17．7399．5±11．5BasalRSNA　(%ofmaximum)21．4±1．934．8±3．5?NE(ng/L)287．4±11．2498．5±17．3?

*P<0.05vssham group.

Figure 1.Schematic drawings of rat hypothalamus in coronal section.PVN:paraventricular nucleus; AH:anterior hypothalamic area; 3V:the third cerebral ventricle; RCh:retrochiasmatic area; MPO:medial preoptic nucleus; opt:optic tract; sox:supraoptic decussation; StHy:striohypothalamic nucleus.
圖1大鼠下丘腦PVN微量注射靶點(diǎn)所在腦區(qū)冠狀切片示意圖

3　CHF大鼠PVN內(nèi)AEA含量、FAAH蛋白表達(dá)及免疫熒光檢測

冠脈結(jié)扎8周后，對CHF大鼠PVN內(nèi)AEA含量及FAAH蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CHF組PVN內(nèi)AEA含量減少，F(xiàn)AAH蛋白表達(dá)量及FAAH陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著增加(P<0.05)，見圖2。這些結(jié)果提示PVN內(nèi)AEA含量的減少以及FAAH蛋白表達(dá)的上調(diào)可能與心衰的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

4　PVN注射PF3845對交感驅(qū)動(dòng)和心功能指標(biāo)的影響

Figure 2.The AEA content (A),FAAH protein expression (B) and average number of FAAH-positive neurons (C) in PVN in the rats with CHF.Scale bar=20 μm.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group.
圖2大鼠PVN內(nèi)AEA含量、FAAH蛋白表達(dá)及FAAH陽性神經(jīng)元數(shù)量

Figure 3.The effect of microinjection of PF3845 to PVN on the sympathetic drive and cardiac function indexes.A:original tracings of artery blood pressure (ABP); B:original tracings of renal sympathetic nerve activity (RSNA); C:mean arterial pressure (MAP); D:renal sympathetic nerve discharge (RSND); E:heart rate (HR); F:plasma norepinephrine (NE); G:ejection fraction (EF); H:fractional shortening (FS).Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham+vehicle (0 nmol PF3845) group;?P<0.05vsCHF+vehicle (0 nmol PF3845) group.
圖3PVN內(nèi)微量灌注PF3845對交感驅(qū)動(dòng)和心功能指標(biāo)的影響

與溶劑對照組相比，CHF組大鼠PVN內(nèi)微量注射FAAH抑制劑PF3845導(dǎo)致MAP、HR和RSNA和血漿NE明顯降低，同時(shí)EF和FS增加(P<0.05)，在注射25～40 min時(shí)變化最為明顯，見圖3。結(jié)果提示抑制FAAH可能導(dǎo)致AEA含量增加，從而通過抑制交感驅(qū)動(dòng)改善心衰大鼠心臟功能。

5　PVN注射AEA對交感驅(qū)動(dòng)和心動(dòng)能指標(biāo)的影響

與溶劑對照組相比，微量注射AEA到CHF組大鼠PVN中可導(dǎo)致MAP、HR、RSNA和血漿NE水平明顯降低，而EF和FS明顯升高(P<0.05)，且注射20～25 min時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)開始出現(xiàn)變化，見圖4。這些結(jié)果提示外源AEA可能通過抑制交感驅(qū)動(dòng)而改善心衰大鼠心臟功能。

Figure 4.The effect of microinjection of AEA to PVN on the sympathetic drive and cardiac function indexes.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham+vehicle (0 nmol AEA) group;?P<0.05vsCHF+vehicle (0 nmol AEA) group.
圖4PVN內(nèi)微量灌注AEA對交感驅(qū)動(dòng)和心功能指標(biāo)的影響

6　靜脈注射AEA

與溶劑對照組相比，假手術(shù)組和CHF組大鼠靜脈注射2倍于PVN內(nèi)微量注射劑量的AEA對MAP、HR和RSNA均無明顯影響(P>0.05，數(shù)據(jù)未在文中顯示)。這一結(jié)果提示AEA產(chǎn)生的交感抑制作用主要是通過中樞下丘腦室旁核來完成的。

7　FAAH基因敲減對交感驅(qū)動(dòng)和心功能指標(biāo)的影響

與sham+Sc-shRNA組相比，CHF+Sc-shRNA組室旁核內(nèi)FAAH蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；然而，與CHF+Sc-shRNA組相比，CHF+FAAH-shRNA組室旁核內(nèi)FAAH蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，提示rAAV2-hSyn-FAAH-shRNA病毒可有效沉默PVN內(nèi)FAAH基因，見圖5。FAAH基因敲減(即微量注射病毒)4周后，檢測CHF組及假手術(shù)組大鼠心功能及其交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)，結(jié)果顯示敲減PVN內(nèi)FAAH基因表達(dá)可顯著改善CHF大鼠心功能(P<0.05)，見表4，且CHF組大鼠交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)顯著降低(P<0.05)，見圖6。

討　　論

本研究運(yùn)用超聲心動(dòng)圖、神經(jīng)電生理、Western blot及高效液相色譜分析等技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)PVN內(nèi)FAAH表達(dá)量顯著上調(diào)，AEA生成量顯著減少；在CHF大鼠模型PVN內(nèi)微量注射AEA、PF3845及rAAV2-FAAHshRNA病毒后，CHF組交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)顯著降低，心功能獲得明顯改善，研究結(jié)果提示抑制PVN內(nèi)FAAH蛋白的表達(dá)可能通過增加AEA含量，從而抑制交感神經(jīng)興奮性。

Figure 5.The effects ofFAAHgene knockdown on the protein expression of FAAH in PVN.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham+Sc-shRNA group;?P<0.05vsCHF+Sc-shRNA group.
圖5PVN內(nèi)敲減FAAH基因?qū)AAH蛋白表達(dá)的影響

表4敲減PVN內(nèi)FAAH基因?qū)Υ笫笮呐K解剖、超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響
Table 4.The effect of knockdown ofFAAHgene in PVN on the indexes of anatomy,hemodynamics and sympathetic drive in the CHF rats and the sham rats (Mean±SEM.n=6)

IndexSham+Sc?shRNASham+FAAH?shRNACHF+Sc?shRNACHF+FAAH?shRNABW(g)367±4359±4395±6397±6HW(g)1．38±0．041．36±0．051．69±0．03?1．57±0．02?RV/BW(mg/g)0．71±0．110．63±0．281．57±0．21?0．91±0．32?LW/BW(mg/g)6．21±0．316．17±0．2914．01±0．32?9．12±0．53?IS(%)0034±3?31±2LVEDV(mL)0．34±0．080．32±0．050．89±0．03?0．64±0．04?LVEDD(mm)6．26±0．255．89±0．369．79±0．33?7．41±0．43?EF(%)67．10±4．2473．10±5．8241．20±3．98?60．30±3．51?FS(%)41．30±2．5742．20±0．8928．50±1．55?34．20±2．31?LVSP(mmHg)118±3113±2102±4?109±5?LVEDP(mmHg)3．5±2．12．8±1．121．7±3．8?12．3±3．6?dp/dt(mmHg/s)7893±2147902±3194093±298?4958±271?

*P<0.05vssham+Sc-shRNA group;?P<0.05vsCHF+Sc-shRNA group.

Figure 6.The effects ofFAAHgene knockout on sympathetic drive.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham+Sc-shRNA group;?P<0.05vsCHF+Sc-shRNA group.
圖6PVN內(nèi)FAAH基因敲減對大鼠交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)的影響

在本次研究中，對假手術(shù)和CHF組大鼠雙側(cè)室旁核進(jìn)行微量注射不同濃度的AEA和PF3845，實(shí)時(shí)監(jiān)測假手術(shù)和CHF組大鼠的MAP、HR和RSNA的變化，結(jié)果顯示在注射AEA和PF3845后，CHF組MAP、HR和RSNA和血漿NE水平均減少且心功能明顯改善，可能機(jī)制為CHF狀態(tài)下FAAH高表達(dá)，使得AEA生成量減少，交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)增強(qiáng)，心功能降低；相反，當(dāng)抑制FAAH活性時(shí)，AEA含量增加，CHF原本增強(qiáng)的交感驅(qū)動(dòng)受到的抑制作用較大，而假手術(shù)組大鼠PVN內(nèi)內(nèi)源性FAAH活性相對較低，故抑制PVN內(nèi)FAAH活性或增加AEA濃度后，對假手術(shù)組大鼠交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)影響不如CHF組明顯。選擇冠脈結(jié)扎4周的大鼠，對CHF組與假手術(shù)組分別進(jìn)行雙側(cè)PVN內(nèi)rAAV2-FAAHshRNA病毒轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染2周后，CHF組與假手術(shù)組的交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)均無明顯變化，3周后交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)開始出現(xiàn)明顯變化且隨著時(shí)間的推移其變化越顯著，因此本研究中我們選用了病毒轉(zhuǎn)染4周的動(dòng)物模型進(jìn)行交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)的檢測。

與本研究結(jié)果相矛盾的是，Niederhoffer等[15]曾報(bào)道在兔腦池中注入AEA，會(huì)增強(qiáng)交感神經(jīng)興奮性。但腦池中核團(tuán)眾多，具體是哪個(gè)核團(tuán)發(fā)揮作用，尚不明確。且兔與鼠雖然同屬小型哺乳動(dòng)物，但其基因仍有很大差異。然而，有學(xué)者指出在孤束核中AEA能夠通過延長壓力反射時(shí)，從而抑制交感神經(jīng)放電；另有研究報(bào)道顯示，在麻醉大鼠PVN內(nèi)注射AEA可導(dǎo)致動(dòng)脈血壓降低[14]，該報(bào)道結(jié)果提示心血管自主調(diào)節(jié)神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)AEA發(fā)揮交感傳出抑制作用，這與本研究結(jié)果相一致。

當(dāng)然本研究中也存在著許多的不足，為此我們將其歸納為以下幾點(diǎn)：(1)本研究結(jié)果雖然提示了CHF狀態(tài)下FAAH可通過水解AEA激活交感傳出神經(jīng)興奮性，但其具體通過哪條信號(hào)通路發(fā)揮的作用，目前尚不明確，這也是本課題組接下來的研究重點(diǎn)；(2)本研究雖然證實(shí)在PVN內(nèi)AEA的濃度變化對交感神經(jīng)興奮性產(chǎn)生相應(yīng)的影響，但也已有報(bào)道指出AEA不存儲(chǔ)于突觸泡中，而是“按需求”合成，是否有其它因子參與了AEA對交感神經(jīng)興奮性的調(diào)節(jié)，目前仍不明確。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，CHF狀態(tài)下，PVN內(nèi)FAAH蛋白表達(dá)量增加，可能進(jìn)一步水解AEA，使AEA含量降低，進(jìn)而導(dǎo)致了交感神經(jīng)興奮亢進(jìn)。本研究所證實(shí)的CHF狀態(tài)下PVN內(nèi)FAAH上調(diào)介導(dǎo)CHF大鼠交感神經(jīng)興奮亢進(jìn)這一假說，雖不能直接應(yīng)用于臨床，但為臨床上CHF基因治療提供了實(shí)驗(yàn)室理論依據(jù)，為治療CHF疾病提供了新的靶點(diǎn)。

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