小鼠乳腺增生組織中BMP信號通路的改變*

孫　麗，郭東輝，劉　飛，蔣　寧，鄭洪新

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110847)

乳腺增生癥是育齡期女性的常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率在所有乳腺疾病中居于首位，同時(shí)也增加了乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。體內(nèi)激素水平失衡及乳腺組織內(nèi)激素受體表達(dá)的異常是乳腺增生發(fā)生的主要原因[3]，但目前對乳腺增生的分子特征仍知之甚少。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是一類分泌性分子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGFβ)超家族的成員之一。目前已知有20多個(gè)BMPs，它們與細(xì)胞膜上絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(如 BMPR1和BMPR2)結(jié)合，磷酸化Smad1/5/9，引起一系列的級聯(lián)反應(yīng)，激活下游靶基因的表達(dá)[4]。而BMPs與其受體的結(jié)合主要受到分泌性拮抗劑[如Noggin、Chordin (Chrd)、Chordin-like 1 (Chrdl 1)、Chordin-like 2(Chrdl 2)和Twsg1等]的調(diào)控[4]。BMP信號通路作為參與乳腺發(fā)生、發(fā)育和癌變的主要信號通路[5-6]，其在乳腺增生中的表達(dá)和激活情況仍然未知。因此，明確BMP信號通路在乳腺增生組織中的表達(dá)和激活情況，可能為治療乳腺增生提供新的思路，對降低乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

因此，本研究以小鼠為研究對象，聯(lián)合使用戊酸雌二醇和黃體酮誘導(dǎo)小鼠乳腺增生，通過real-time PCR檢測BMP信號通路的配體、受體、拮抗劑在乳腺增生組織中的表達(dá)，并用Western blot鑒定該通路的激活，從BMP信號通路的角度闡釋乳腺增生的分子特征和發(fā)病機(jī)制。

材　料　和　方　法

1　主要試劑

戊酸雌二醇片(Bayer HealthCare)；黃體酮注射液(浙江仙居制藥股份有限公司)；洋紅(carmine；購自Sigma)；柱式動(dòng)物組織總RNA抽提純化試劑盒(生工生物)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒ProtoScript? II First Strand cDNA Synthesis Kit (New England Biolabs)；熒光定量PCR試劑盒Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix (Angilent)；抗p-Smad1/5/9抗體(Cell Signaling Technology)；抗Smad1/5/9抗體(Immunoway)；抗β-actin抗體(恩晶生物)。

2　主要方法

2.1動(dòng)物分組與給藥30只SPF級7周齡雌性未孕C57BL/C小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號為11400700088478。動(dòng)物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12 h光循環(huán)，室溫22～25 ℃，空氣相對濕度40%～60%。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為對照(control)組和激素(hormone)組，每組15只。激素組每天給予戊酸雌二醇混懸液2.5 mg/kg灌胃，連續(xù)給藥25 d；再連續(xù)5 d，每天腹腔注射4 mg/kg的黃體酮；對照組給以相應(yīng)體積的PBS。給藥結(jié)束后，頸椎脫臼處死動(dòng)物，收集乳腺進(jìn)行檢測。

2.2乳腺整體染色取小鼠第4對乳腺，在載玻片上展開晾干，Carnoy’s固定液固定過夜，50%乙醇浸泡30 min，蒸餾水浸泡30 min，洋紅染液染色24 h，水洗、乙醇梯度脫水，二甲苯中浸泡2 d，樹膠封片，數(shù)碼相機(jī)(Canon)拍照。

2.3Real-time PCR稱取乳腺組織50 mg，按照試劑盒說明書提取總RNA。取1 μg的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA稀釋5倍后用于real-time PCR檢測。PCR反應(yīng)條件94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s、59 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；用2-△△Ct法計(jì)算并分析mRNA的相對表達(dá)量。PCR引物見表1。

表1　Real-time PCR引物序列Table 1.Primer sequences for real-time PCR

F:forward； R:reverse.

2.4Western blot稱取乳腺組織50 mg，液氮研磨成粉，加入到300 μL蛋白裂解液中，4 ℃裂解15 min，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度。每樣取50 μg總蛋白，常規(guī)法進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠濃度10%)。電泳后轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉，加 I 抗，4 ℃孵育過夜，加HRP標(biāo)記的 II 抗，ECL顯色。用ImageJ軟件分析各條帶灰度。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　激素處理后小鼠乳腺形態(tài)的變化

洋紅染色結(jié)果可見，與對照組相比，激素組小鼠乳腺組織密度明顯增加，導(dǎo)管分支和末端乳芽的數(shù)量增多，乳腺呈現(xiàn)增生狀態(tài)，說明聯(lián)合使用戊酸雌二醇和黃體酮能成功誘導(dǎo)小鼠乳腺增生，見圖1。

2　BMP信號分子在乳腺增生組織中的mRNA表達(dá)水平

運(yùn)用real-time PCR的方法，檢測了BMP信號通路配體、受體和拮抗劑在乳腺增生組織中的表達(dá)，首先檢測了BMP信號通路配體BMP2、3、4、5、6、7、9、12、13和14的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，BMP2、4、6、7和14 的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，BMP5、9、13的mRNA的表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，BMP3和BMP12的mRNA的表達(dá)水平無明顯變化，見圖2。

Figure 1.Whole-mount staining of mammary glands.The square areas are enlarged in the right bottom corners to demonstrate the terminal duct branches and terminal end buds.The scale bar=1 cm.
圖1乳腺整體染色結(jié)果

Figure 2.The mRNA expressions of BMP ligands in mouse mammary glands with hyperplasia.Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.
圖2BMP信號通路配體在小鼠乳腺組織中的表達(dá)

BMP信號通路有I型受體和II型受體。本實(shí)驗(yàn)檢測2個(gè)常見的I型受體BMPR1A和BMPR1B及1個(gè)II型受體BMPR2在乳腺組織中的表達(dá),結(jié)果顯示在乳腺增生組織中只有BMPR1A的mRNA表達(dá)水平輕微下降(P<0.05)，而BMPR1B和BMPR2的mRNA表達(dá)水平則無明顯變化，見圖3。

BMP信號通路中常見的拮抗劑Chrd、Chrdl1、Chrdl2、Noggin和Twsg1等也在乳腺中表達(dá)。結(jié)果顯示，Chrdl1在增生的乳腺組織中的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，Twsg1的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而其它3個(gè)分子的mRNA表達(dá)較正常乳腺組織則無明顯變化，見圖4。

3　BMP信號通路在乳腺增生組織中激活情況

BMP信號通路的激活以Smad1/5/9蛋白的磷酸化為標(biāo)志。Western blot結(jié)果顯示，與正常乳腺相比，乳腺增生組織中p-Smad1/5/9的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，這說明BMP信號通路在乳腺增生組織中被激活，見圖5。

Figure 3.The mRNA expressions of BMP receptors in mouse mammary glands with hyperplasia.Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.
圖3BMP信號通路受體在小鼠乳腺組織中的表達(dá)

Figure 4.The mRNA expressions of BMP antagonists in mouse mammary glands with hyperplasia.Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.
圖4BMP信號通路拮抗劑在小鼠乳腺組織中的表達(dá)

Figure 5.The expression of p-Smad 1/5/9 in mouse mammary glands with hyperplasia.Mean±SD.n=7.*P<0.05vscontrol group.
圖5p-Smad1/5/9在小鼠乳腺組織中的水平

討　　論

乳腺增生癥本質(zhì)上是一種生理增生與復(fù)舊不全造成的乳腺正常結(jié)構(gòu)的紊亂，主要原因是體內(nèi)雌、孕激素水平失衡及乳腺組織內(nèi)激素受體表達(dá)的異常，但該疾病的分子特征仍不明確。本研究以BMP信號通路為切入點(diǎn)研究乳腺增生組織的分子特征，發(fā)現(xiàn)BMP信號通路的配體BMP2、4、5、6、7、9、13和14，受體BMPR1A，以及拮抗劑Chrdl1和Twsg1等在乳腺增生組織中異常表達(dá)，其中BMP2、4、6、7、14和Twsg1表達(dá)上調(diào)，BMP5、9、13、BMPR1A和Chrdl1的表達(dá)下調(diào)。這些BMP分子的異常表達(dá)導(dǎo)致BMP信號通路的激活。

BMPs廣泛地參與到乳腺的發(fā)生、發(fā)育和癌變的各個(gè)過程。BMP2和BMP4在乳腺發(fā)育過程中主要參與調(diào)控乳腺干細(xì)胞/祖細(xì)胞的命運(yùn)，BMP2主要促進(jìn)乳腺干細(xì)胞向管腔細(xì)胞的分化和管腔祖細(xì)胞群的擴(kuò)增，BMP4主要促進(jìn)乳腺干細(xì)胞/肌上皮祖細(xì)胞的增殖[7]。因此，在乳腺增生組織中發(fā)現(xiàn)BMP2和BMP4表達(dá)水平的升高并不難理解。在乳腺增生過程中雌激素和孕激素可能通過上調(diào)BMP2和BMP4的表達(dá)促進(jìn)乳腺干細(xì)胞的增殖和分化，從而促進(jìn)乳腺導(dǎo)管數(shù)量和分支的增加，致使乳腺上皮增生。已知BMP5在小鼠孕期乳腺導(dǎo)管分支增加過程中表達(dá)量下降[8]，而乳腺增生的過程也伴隨著乳腺導(dǎo)管數(shù)量的增加，因此，本研究中也觀察到BMP5的下降。BMP6、7、9的研究多見于乳腺癌，主要功能是抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[9-10]。本研究觀察到BMP9在乳腺增生組織中下調(diào)，這可能是乳腺細(xì)胞增殖所需，而同時(shí)BMP6和BMP7的表達(dá)在乳腺增生組織中上調(diào)，可能是使乳腺上皮細(xì)胞的增殖控制在一定的范圍內(nèi)，防止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。BMP13和BMP14的在乳腺中的研究還未有報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)BMP13在乳腺增生組織中表達(dá)下調(diào)，而BMP14的表達(dá)上調(diào)，它們的具體功能仍需進(jìn)一步研究。

Chrdl1作為BMP信號通路的拮抗劑，主要抑制BMP4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，它能抑制BMP4誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[11]。本研究中觀察到的Chrdl1在乳腺增生組織中的表達(dá)下調(diào)可能與BMP4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)有關(guān)。Twsg1一般被認(rèn)為是BMP信號通路的拮抗劑，但在乳腺組織中它主要作為BMP信號通路的激動(dòng)劑[12]。在小鼠中全面敲除Twsg1后，乳腺組織中BMP信號通路受到抑制，乳腺導(dǎo)管的延伸推遲、官腔閉塞、二級分支減少[12]，提示Twsg1能促進(jìn)乳腺導(dǎo)管分支的形成。本研究發(fā)現(xiàn)Twsg1在乳腺增生組織中表達(dá)增加，這與乳腺導(dǎo)管分支增加的表型一致。

雌/孕激素聯(lián)合使用對乳腺BMP信號通路的影響目前尚無報(bào)道。僅知在小鼠正常乳腺上皮細(xì)胞EpH4中孕激素受體A的過表達(dá)能引起經(jīng)典BMP-Smad信號通路的激活[13]；在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，雌激素能下調(diào)BMPR1A、BMPR1B、BMP6和BMP7的mRNA水平，但并不激活BMP-Smad信號通路[9]，這說明雌/孕激素能改變BMP信號通路。而本研究證實(shí)聯(lián)合使用雌、孕激素也能引起B(yǎng)MP信號通路的改變，但與雌/孕激素的單獨(dú)作用相比，某些分子(如：BMP6和BMP7)的變化趨勢并不相同甚至相反，這一方面可能是由于體內(nèi)和體外研究差異造成的，另一方面也可能是正常細(xì)胞和癌細(xì)胞不同引起的。

綜上，本研究以小鼠為模型，從BMP信號通路入手，初步揭示了乳腺增生的分子特征，增進(jìn)了對乳腺增生發(fā)生機(jī)制的了解。由于研究結(jié)果基于動(dòng)物模型，仍需要臨床上進(jìn)一步的驗(yàn)證。今后的研究將圍繞特定BMP分子在乳腺增生中的功能展開。

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