欖香烯通過c-Met信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)由肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥作用

陳　琦，李雄英，唐夏燾

(1杭州市第三人民醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 310009； 2浙江省特種設(shè)備檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州310020)

表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)經(jīng)近10年的上市應(yīng)用，對(duì)EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者有較好的臨床療效，但頻繁出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用[1-3]。因此，如何克服 EGFR-TKIs 耐藥以及尋找能夠逆轉(zhuǎn)這種耐藥作用的藥物是目前研究的重要內(nèi)容。欖香烯(β-elemene)是提取于莪術(shù)根莖具有廣泛抗癌作用的有效成分，是我國自行研發(fā)的一種抗癌藥物，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用并且已經(jīng)引入到臨床的治療使用中[4-6]。有文獻(xiàn)報(bào)道肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼(gefitinib，Gef)產(chǎn)生原發(fā)和繼發(fā)性耐藥[7-8]。本研究旨在研究欖香烯對(duì)HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥人肺腺癌PC-9細(xì)胞的影響，并探討其可能機(jī)制。

材　料　和　方　法

1　材料

欖香烯、DMSO、SU11274(c-Met抑制劑)和HGF購自Sigma；吉非替尼購自阿斯利康制藥有限公司；非小細(xì)胞肺癌PC-9細(xì)胞購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫；MTT購于碧云天生物技術(shù)有限公司；抗GAPDH、c-Met、p-Met、AKT及p-AKT抗體購自Cell Signaling。

2　主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理PC-9細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，每3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞加藥處理順序及時(shí)間如下：HGF處理24 h后,再分別加入SU11274、欖香烯或吉非替尼處理24 h。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以5.0×107/L的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度藥物處理。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，每孔加入20 μL MTT(2 g/L)，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液，每孔再加DMSO 150 μL，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)值。每個(gè)濃度設(shè)平行重復(fù)6孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

2.3Transwell小室實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-9細(xì)胞，消化細(xì)胞于無血清培養(yǎng)基，制成8×107/L的細(xì)胞懸液，在Transwell小室的上室中加入含有不同濃度藥物的細(xì)胞懸液200 μL，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦掉基質(zhì)膠及上室未穿膜的細(xì)胞，甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色40 min。100倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)目，取平均值。

2.4Western blot法檢測(cè)蛋白水平各組細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液裂解30 min，冰上進(jìn)行操作。收集到EP管，BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度定量，加入緩沖液于95～100 ℃煮沸5 min，即為樣本蛋白。每個(gè)泳道蛋白樣品10 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE后，利用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別加入對(duì)應(yīng) I 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次后，加入對(duì)應(yīng) II 抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光、顯影、定影后進(jìn)行分析。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用Bonferroni檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　欖香烯對(duì)肺癌PC-9細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著給藥劑量的增加，欖香烯對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率呈顯著上升趨勢(shì)，在給藥24 h后，欖香烯的半數(shù)抑制濃度(half maximal mhibitory concentration，IC50)為169.31 mg/L。結(jié)果表明，欖香烯作用肺癌PC-9細(xì)胞后，細(xì)胞活力被顯著抑制，見圖1。

Figure 1.The effect of β-elemene on the cell viability in diffe-rent groups after 24 h.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L.
圖1不同濃度的欖香烯對(duì)肺癌PC-9細(xì)胞活力的影響

2　c-met抑制劑SU11274對(duì)HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥細(xì)胞的影響

首先，我們用MTT法檢測(cè)不同濃度的SU11274對(duì)PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的不斷增加，其生長(zhǎng)抑制率也隨之增加。由于1 μmol/L的SU11274對(duì)PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎沒有抑制作用，故選擇1 μmol/L的SU11274進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。吉非替尼作用于HGF(50 μg/L)誘導(dǎo)的細(xì)胞后，其IC50值比吉非替尼單獨(dú)作用組明顯增高，而SU11274聯(lián)合不同濃度吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞后，在相同藥物濃度下細(xì)胞存活率比單獨(dú)吉非替尼作用組明顯降低，其IC50值明顯降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.SU11274 increased inhibition of cell activity induced by Gef.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L.
圖2SU11274增強(qiáng)Gef誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制

3　欖香烯逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺癌PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感，隨著吉非替尼濃度的增加，其對(duì)PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用不斷增強(qiáng)，IC50為0.30 μmol/L。加入外源性HGF(50 μg/L)作用24 h對(duì)肺癌PC-9細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，且能誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥，其IC50為0.66 μmol/L。由上述欖香烯MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，低濃度的欖香烯對(duì)細(xì)胞活力無明顯的抑制作用，故選擇10 mg/L濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。10 mg/L欖香烯與吉非替尼聯(lián)合作用于由HGF誘導(dǎo)吉非替尼耐藥的PC-9細(xì)胞時(shí)，欖香烯可有效地逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥，吉非替尼的IC50值為0.31 μmol/L，見圖3。

Figure 3.The effects of β-elemene on IC50value of Gef in PC-9 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGef;##P<0.01vsGef+HGF.
圖3欖香烯逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥

4　在外源性HGF存在的情況下，欖香烯聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌PC-9細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HGF能顯著提高肺癌PC-9細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01)；在外源性HGF存在的情況下，與吉非替尼單獨(dú)作用組相比，欖香烯聯(lián)合吉非替尼能明顯抑制肺癌PC-9細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01)，見圖4。

5　欖香烯聯(lián)合吉非替尼對(duì)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥PC-9細(xì)胞c-Met通路相關(guān)蛋白的影響

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HGF可顯著上調(diào)p-Met及其下游p-AKT的蛋白水平，提示HGF能明顯刺激肺癌PC-9細(xì)胞中c-Met和AKT蛋白的磷酸化；在外源性HGF存在的情況下，與吉非替尼作用組相比，欖香烯聯(lián)合吉非替尼能明顯抑制由HGF激活的c-Met和AKT磷酸化水平(P<0.01)，各作用組對(duì)c-Met和AKT總蛋白表達(dá)變化不大，見圖5。

討　　論

近年來我國肺癌死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，已躍居腫瘤死因的第1位，其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的80%。由于大多數(shù)肺癌患者在診斷時(shí)已處晚期，因而失去了很多早期治療的機(jī)會(huì)[9]。隨著分子靶向藥物的面世，尤其是EGFR-TKIs的出現(xiàn)，為晚期NSCLC的治療開辟了新的治療途徑。吉非替尼是一種口服的可逆性EGFR抑制劑，其可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，直接作用于EGFR的胞內(nèi)區(qū)，干擾三磷酸腺苷結(jié)合，抑制酪氨酸激酶的磷酸化，從而阻斷細(xì)胞增殖和血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡[10-11]。吉非替尼在臨床應(yīng)用過程中，對(duì)EGFR突變的NSCLC患者有較好的臨床療效[12]，然而頻繁出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象限制了其進(jìn)一步的發(fā)展[13-14]。

Figure 4.The impact of β-elemene on HGF-induced resistance to Gef in PC-9 cells was determined by Transwell migration assay (×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsGef+HGF group.
圖4欖香烯對(duì)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥PC-9細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 5.The protein levels of p-Met and p-AKT in HGF-induced resistance to Gef in PC-9 cells treated with β-elemene.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsGef+HGF group.
圖5欖香烯對(duì)由HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥PC-9細(xì)胞中c-Met及其下游通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

盡管近年來關(guān)于腫瘤細(xì)胞耐藥性的研究很多，但是，由于這些逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物本身具有的毒性而阻礙了其臨床廣泛應(yīng)用，所以真正進(jìn)入臨床的藥物就更少了。中草藥毒副作用較小，是逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的重要研究方向。欖香烯是從天然中草藥姜科姜黃屬植物莪術(shù)中提取分離的倍半萜烯類化合物，目前廣泛用于多種惡性腫瘤的治療，且取得了較好的治療效果[15]，近年研究發(fā)現(xiàn)它可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥[16-17]。

NSCLC患者存在原發(fā)性或獲得性對(duì)EGFR-TKIs耐藥，其耐藥機(jī)理尚未完全明確，EGFR的二次突變與MET基因的擴(kuò)增被認(rèn)為是吉非替尼獲得性耐藥的重要機(jī)制。研究報(bào)道，在EGFR-TKIs耐藥患者中，常可檢測(cè)到HGF的過表達(dá)。HGF與特異性c-Met受體結(jié)合而發(fā)揮作用，促進(jìn)多種組織細(xì)胞增生分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和血管生成[18]。c-Met廣泛存在于多種正常組織細(xì)胞和體內(nèi)外惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)。異常的HGF/c-Met信號(hào)途徑與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在NSCLC患者中c-Met陽性表達(dá)者比c-Met陰性表達(dá)者存活率低，HGF和c-Met共表達(dá)者比任何一種陽性表達(dá)者或者兩種均陰性表達(dá)者相比存活率明顯降低[19]。然而，目前欖香烯逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥是否通過HGF/c-Met信號(hào)通路尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，外源性HGF(50 μg/L)對(duì)肺癌PC-9細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)誘導(dǎo)吉非替尼耐藥。欖香烯聯(lián)合不同濃度吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)耐藥的PC-9細(xì)胞時(shí)其存活率比吉非替尼單獨(dú)作用時(shí)明顯降低，說明欖香烯能逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥。同時(shí)，HGF能顯著提高肺癌PC-9細(xì)胞的侵襲能力，而欖香烯能削弱由HGF誘導(dǎo)的肺癌PC-9細(xì)胞的侵襲能力。HGF能明顯增加肺癌PC-9細(xì)胞中p-Met和p-AKT的表達(dá)水平；與吉非替尼組相比，欖香烯聯(lián)合吉非替尼能明顯抑制由HGF激活的c-Met和AKT磷酸化。相同的是，使用c-Met抑制劑SU11274聯(lián)合吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞時(shí)其存活率也比吉非替尼單獨(dú)作用時(shí)明顯降低。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步研究表明欖香烯能夠逆轉(zhuǎn)由HGF誘導(dǎo)肺癌PC-9細(xì)胞的吉非替尼耐藥，其機(jī)制可能與抑制HGF活化的c-Met及其下游信號(hào)通路有關(guān)。

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