富含γ-氨基丁酸豆芽乳發(fā)酵工藝優(yōu)化

張金蘭　代田田　王丹婷　李平蘭

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083)

0　引言

氨基丁酸(GABA)是一種非蛋白質(zhì)、水溶性的氨基酸，主要是由谷氨酸脫羧酶(GAD，EC 4.1.1.15)催化L-谷氨酸脫羧而產(chǎn)生，通過線粒體GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T，EC 2.6.1.19)轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛來代謝。GABA是主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可以通過降低血壓、預(yù)防慢性酒精性疾病、抑制癌細(xì)胞增殖、改善腦功能、促進(jìn)胰島素釋放為人類和其他動(dòng)物的健康提供有益的影響[1-2]。盡管GABA廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，但其含量很低，這激發(fā)了研究者開發(fā)富含γ-氨基丁酸食品的興趣。

乳酸菌在最近幾年被應(yīng)用于GABA生產(chǎn)。例如，短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等應(yīng)用于富含GABA的食品和藥品合成[3-5]。產(chǎn)GABA的乳酸菌大多在合成或半合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵后GABA的純化是必不可少的，這將增加生產(chǎn)的時(shí)間和成本。應(yīng)用天然的培養(yǎng)基(如乳制品、谷物、水果、蔬菜等)來培養(yǎng)乳酸菌，獲得富含GABA的食品可以避免上述問題，由此成為有價(jià)值的研究方向。

豆芽富含膳食纖維、多種營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性成分[6]。大豆發(fā)芽并經(jīng)適當(dāng)處理后，不僅增加了人體必需的氨基酸和維生素，提高了大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也減少了豆腥味。在大豆發(fā)芽過程中，隨著蛋白質(zhì)的降解，產(chǎn)生了多種的游離氨基酸，這為GABA的合成提供了天然的底物。

研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生GABA的能力，受培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)條件和其他因素的影響[7]。優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)于提高發(fā)酵過程中GABA的產(chǎn)量非常重要。響應(yīng)面法(Response surface optimization, RSM)是一個(gè)組合統(tǒng)計(jì)學(xué)和數(shù)學(xué)用于優(yōu)化生物過程的技術(shù)。它可以用來評(píng)估幾個(gè)影響因素的影響，通過同時(shí)改變幾個(gè)因素，進(jìn)行有限數(shù)量試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)擬合建模。依據(jù)對(duì)影響GABA生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，選擇一個(gè)獨(dú)立的變量，RSM用于優(yōu)化培養(yǎng)因素以提升GABA的產(chǎn)量。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD)和響應(yīng)面分析法建立高產(chǎn)γ-氨基丁酸植物乳桿菌發(fā)酵的數(shù)學(xué)模型，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，提高植物乳桿菌發(fā)酵豆芽乳γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度，為開發(fā)新型的高營(yíng)養(yǎng)功能食品提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

菌種，植物乳桿菌S-35(LactobacillusplantarumS-35)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物研究室提供，分離自農(nóng)家酸漿水[8]；大豆種子(2016年秋季收獲)，北大荒集團(tuán)；MRS (de Man, Rogosa and Sharpe)合成培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、四硼酸鈉、次氯酸鈉、氯化鈉、苯酚、無(wú)水乙醇均為分析純，由西隴化工股份有限公司提供。

1.2　儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；YXQ-LS-SⅡ型全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DNP-9102型恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司； S23C型pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；3K15型臺(tái)式高速離心機(jī)，五洲東方科技發(fā)展有限公司；SCL-1300型超凈工作臺(tái)，北京賽伯樂儀器有限公司；SPX-250B-Z型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠； 101型鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；DYJ-S6365型芽苗菜種植機(jī)，廣東小熊電器有限公司；JYL-C010型九陽(yáng)料理機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1豆芽乳的制備

精選大豆，清洗，0.25%次氯酸鈉溶液浸泡30 min(除去大豆種子表面的微生物)， 用無(wú)菌水清洗后，放入發(fā)芽機(jī)發(fā)芽，觀察每天的發(fā)芽狀況，分別取出1、2、3、4、5 d的豆芽制備豆芽乳。

豆芽用清水漂洗， 然后用95℃熱水浸泡3 min，殺酶鈍化， 熱磨(水溫80℃)， 均質(zhì)，加水過濾，調(diào)整豆芽乳干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%， 添加 6%蔗糖[9]，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠓盅b， 90℃、30 min處理后待用。

1.3.2豆芽乳發(fā)酵試驗(yàn)

將不同發(fā)芽時(shí)間的豆芽乳， 分別接種3%發(fā)酵劑，于37℃培養(yǎng)，觀察凝固狀態(tài)，記錄凝乳時(shí)間， 計(jì)算乳酸菌活菌數(shù)及γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度。

1.3.3豆芽乳發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

(1)乳酸菌接種量

以植物乳桿菌S-35(5.8×109CFU/mL)為試驗(yàn)對(duì)象，在發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時(shí)間為24 h的條件下，研究不同的接種量(1%、2%、3%、4%、5%)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，以不同接種量下的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為試驗(yàn)指標(biāo)。

(2)發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵條件為上述單因素試驗(yàn)選出的最佳水平，研究不同的發(fā)酵時(shí)間(12、24、36、48、60 h)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，以不同發(fā)酵時(shí)間的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為試驗(yàn)指標(biāo)。

(3)發(fā)酵溫度

發(fā)酵條件均為上述單因素試驗(yàn)選出的最佳水平，研究不同的發(fā)酵溫度(25、28、31、34、37℃)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，以不同發(fā)酵溫度的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為試驗(yàn)指標(biāo)。

1.3.4響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵工藝的試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計(jì)(CCD)方法，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為自變量， γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0.6確定最佳發(fā)酵工藝條件。

1.3.5GABA的提取方法

采用2倍體積的60%乙醇進(jìn)行提取；提取條件為70℃恒溫水浴回流2 h； 10 000 r/min離心10 min，取上層清液測(cè)定[10]。

1.3.6GABA的檢測(cè)方法

采用Berthelot 反應(yīng)測(cè)定GABA的質(zhì)量濃度[10]。

取不同質(zhì)量濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)液0.4 mL，加0.2 mol/L(pH 值9.0)硼酸鹽緩沖液0.6 mL，搖勻，加5%苯酚溶液2 mL，搖勻，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%次氯酸鈉溶液1 mL，搖勻，放入沸水浴加熱5 min，立即置冰浴中5 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入2.0 mL 60%酒精，在645 nm處測(cè)定溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，GABA的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。把處理的樣品按以上方法測(cè)吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中GABA的質(zhì)量濃度。

以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L質(zhì)量濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。由圖1可知，吸光度與γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度高度相關(guān)，R2=0.998 8，二者之間的關(guān)系滿足回歸方程

y=0.124x+0.004 5。

圖1　GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　GABA standard curve

1.3.7乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定

將不同條件發(fā)酵豆芽乳，分別用滅菌生理鹽水制備10倍系列稀釋樣品勻液，選擇適宜稀釋度的樣品勻液，分別吸取1 mL于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，計(jì)算每皿中的菌落數(shù)，求其平均值，乘以稀釋倍數(shù)，乳酸菌活菌數(shù)以CFU/mL為單位。

1.3.8產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

由5名男性和5名女性組成感官鑒評(píng)小組，并接受感官鑒定培訓(xùn)。小組成員對(duì)發(fā)酵豆乳的色澤、組織狀態(tài)、氣味和滋味以及綜合接受程度指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。將5項(xiàng)的平均分作為感官評(píng)分。計(jì)算總分得出結(jié)論，60分以上即為可接受，80分以上為風(fēng)味優(yōu)良，60分以下為不可接受。

表1　感官評(píng)價(jià)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1　Scoring criteria of sensory evaluation

1.3.9數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均為平行測(cè)定 3 次以上取平均值，并計(jì)算出正負(fù)標(biāo)準(zhǔn)偏差，用誤差線表示。采用Design-Export 8.0.6 數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，應(yīng)用中心點(diǎn)法對(duì)各組變量的計(jì)算結(jié)果進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析，P<0.05 表明分析結(jié)果的差異性顯著，P<0.01表明分析結(jié)果的差異性極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　黃豆發(fā)芽時(shí)間的確定

發(fā)芽時(shí)間為0～5 d的豆芽乳，分別接種3%發(fā)酵劑，于37℃培養(yǎng)，在20～24 h凝乳較好。由表2可知，發(fā)酵豆芽乳的感官品質(zhì)和γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度與豆芽的發(fā)酵時(shí)間密切相關(guān)。與其他發(fā)芽時(shí)間的大豆相比，發(fā)芽1 d的豆芽發(fā)酵乳明顯地提高了γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度，并改善了感官品質(zhì)。發(fā)芽0 d的豆芽發(fā)酵乳有明顯的豆腥味，而豆腥味是豆乳消費(fèi)量遠(yuǎn)低于牛奶的重要原因。當(dāng)發(fā)芽時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，隨著大豆蛋白在萌發(fā)過程中被內(nèi)源酶的進(jìn)一步降解，導(dǎo)致發(fā)酵豆芽乳凝乳不完全、青芽味逐漸顯現(xiàn)、口感差，不適用于制作發(fā)酵豆芽乳。因此，選擇發(fā)芽1 d的大豆芽進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表2　不同的大豆發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆芽乳的影響Tab.2　Effects of different germination time on fermented milk with sprouted soybeans

2.2　酸豆芽乳發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

2.2.1植物乳桿菌S-35接種量

固定發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間20 h，考察接種量對(duì)γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的影響。由圖2可知，隨著接種量的升高，GABA質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在接種量為3%時(shí)，GABA質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，為0.66 g/L。中心組合試驗(yàn)選取的接種量范圍為2%～4%。

圖2　接種量對(duì)GABA質(zhì)量濃度的影響Fig.2　Effects of various inoculation percentages on GABA yields

2.2.2發(fā)酵時(shí)間

固定發(fā)酵溫度37℃、接種量為3%，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的影響。由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，GABA質(zhì)量濃度呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，GABA質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，為0.71 g/L。中心組合試驗(yàn)選取的發(fā)酵時(shí)間范圍為12～36 h。

圖3　發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA質(zhì)量濃度的影響Fig.3　Effects of time on GABA yields

2.2.3發(fā)酵溫度

固定發(fā)酵時(shí)間為24 h、接種量為3%，考察發(fā)酵溫度對(duì)γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的影響。由圖4可知，溫度較低時(shí)，GABA的積累量較低，隨著溫度逐漸升高，GABA的產(chǎn)量也明顯升高，當(dāng)溫度為34℃時(shí)，GABA質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，為1.57 g/L，溫度繼續(xù)升高后，GABA的產(chǎn)量有所減少。GABA的生物合成與谷氨酸脫羧酶的活性密切相關(guān)，而酶的生物活性會(huì)受到環(huán)境溫度的影響。適宜的發(fā)酵溫度不僅有利于菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)還會(huì)增加酶的生物活性，促進(jìn)酶促反應(yīng)的進(jìn)行[11]。溫度調(diào)整到34℃進(jìn)行發(fā)酵，谷氨酸脫羧酶的生物活性能夠充分發(fā)揮，使GABA大量的積累。中心組合試驗(yàn)選取的發(fā)酵溫度范圍為31～37℃。

圖4　發(fā)酵溫度對(duì)GABA質(zhì)量濃度的影響Fig.4　Effects of various temperatures on GABA yields

2.3　響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1響應(yīng)面模型試驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)CCD的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取植物乳桿菌S-35接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度3個(gè)因素為CCD的自變量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。由單因素試驗(yàn)優(yōu)化出的接種量3%、發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度34℃為中心點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)。以發(fā)酵產(chǎn)品中γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素與編碼見表3。根據(jù)表3進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見表4。表中A、B、C分別為接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度的編碼值，Y為GABA質(zhì)量濃度。

表3　旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)因素編碼Tab.3　Level of factors in central composite design

表4　響應(yīng)面旋轉(zhuǎn)中心組合(CCD)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Tab.4　Design and results of central composite design

2.3.2響應(yīng)面模型的分析

以發(fā)酵產(chǎn)品中γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，由軟件Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行分析，得到的結(jié)果見表5。

經(jīng)回歸擬合后，根據(jù)各項(xiàng)的回歸系數(shù)，刪除不顯著項(xiàng)得到的模型方程為

Y=1.57+0.13A+0.13B+0.044C+0.019AB+
0.064AC-0.029BC-0.18A2-0.31B2-0.31C2

由表5的方差分析可得，該模型達(dá)到極顯著的水平(P<0.000 1)。同時(shí)，該模型的失擬度不顯著(P>0.1)，可見此方程與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合性良好，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，適用于發(fā)酵體系條件的優(yōu)化。信噪比為81.367，遠(yuǎn)大于4，因此該模型可用于預(yù)測(cè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。決定系數(shù)R2=0.998 9，校正決定系數(shù)R2=0.997 9，說明該模型的變量與自變量之間關(guān)系顯著，模型合理可用。

圖5為Design-Expert 8.0.6做出的兩因素自變量對(duì)γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度交互作用的3D 響應(yīng)曲面圖，可知植物乳桿菌接種量與發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度、植物乳桿菌接種量與發(fā)酵時(shí)間響應(yīng)面三維圖均有穩(wěn)定點(diǎn)，且為極大值。

表5　響應(yīng)面旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)(CCD)回歸模型方差分析Tab.5　ANOVA of central composite design

注：** 表示極顯著水平P<0.01，*表示顯著水平P<0.05。

圖5　兩因素對(duì)γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的響應(yīng)曲面Fig.5　Response surface diagrams of two factors on GABA yields

通過響應(yīng)面分析，得到植物乳桿菌發(fā)酵體系最佳工藝條件是接種量3.41%、發(fā)酵時(shí)間26.68 h、發(fā)酵溫度34.31℃，在此條件下γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的預(yù)測(cè)值為1.62 g/L。為了便于實(shí)際操作，對(duì)優(yōu)化條件的參數(shù)取整后，接種量為3.5%，發(fā)酵時(shí)間為27 h，發(fā)酵溫度為34.5℃。為檢驗(yàn)響應(yīng)面模型的可靠性，按上述最佳工藝條件重復(fù)3 次試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)得到的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為1.61 g/L， 與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.6%，可見通過響應(yīng)面優(yōu)化方法得到的發(fā)酵體系最佳工藝條件是可靠的。驗(yàn)證試驗(yàn)得到的發(fā)酵豆芽乳凝固狀態(tài)均勻，乳清析出少，且有濃郁的發(fā)酵香味，風(fēng)味純正，無(wú)異味。經(jīng)測(cè)定最大活菌數(shù)為1.60×109CFU/mL。

2.4　儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)

將發(fā)酵豆芽乳在4℃下冷藏，評(píng)價(jià)了冷藏過程中豆芽乳品質(zhì)的變化。由圖6可知，乳酸菌的活菌數(shù)在儲(chǔ)藏過程中逐漸下降。但在1～7 d時(shí)，活菌數(shù)均大于108CFU/mL，符合乳酸菌發(fā)酵飲料要求。由圖7可知，pH值整體呈下降趨勢(shì)，但是變化較小。這與預(yù)期目標(biāo)一致，篩選的菌種較為合適，后酸化現(xiàn)象較輕。

圖6　4℃儲(chǔ)藏過程中發(fā)酵豆芽乳活菌數(shù)的變化Fig.6　Changes of viable bacterium in fermented sprouted soymilk during storage at 4℃

圖7　4℃儲(chǔ)藏過程中發(fā)酵豆芽乳pH值的變化Fig.7　Changes of pH value in fermented sprouted soymilk during storage at 4℃

根據(jù)表6，在發(fā)酵豆芽乳儲(chǔ)藏期間，發(fā)酵豆乳的感官評(píng)分逐漸下降，4℃冷藏1 d時(shí)感官評(píng)分為90，呈乳白色；組織均勻、細(xì)膩、凝塊結(jié)實(shí)；無(wú)豆腥味、有發(fā)酵豆乳特有香氣；酸甜適中；整體感覺較為理想。1～3 d儲(chǔ)存期內(nèi)品質(zhì)基本不變。冷藏7 d時(shí)感官評(píng)分為60，有一定的乳清析出、顏色稍黃、滋味平淡，整體可接受。綜上，認(rèn)為在4℃冷藏條件下，1～3 d儲(chǔ)存期內(nèi)品質(zhì)優(yōu)良，1～7 d內(nèi)豆乳綜合品質(zhì)較為穩(wěn)定。

表6　感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)Tab.6　Scoring of sensory evaluation

3　討論

許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)乳酸菌產(chǎn)GABA的研究進(jìn)行了報(bào)道，并認(rèn)為乳酸菌是可食用型GABA的良好來源。大多數(shù)乳酸菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的報(bào)道為合成培養(yǎng)基水平的優(yōu)化，如L.plantarumATCCl4917，以化學(xué)限定培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，發(fā)酵初始pH值為5.5，發(fā)酵溫度為37℃，L-谷氨酸鈉濃度為100 mmol/L，接種量為3%，發(fā)酵36 h時(shí)，添加L-谷氨酸鈉發(fā)酵液中GABA濃度為721.35 mmol/L[12];L.plantarumMJ0301，葡萄糖質(zhì)量濃度為16 g/L、氮源(胰蛋白胨、酵母膏質(zhì)量比1∶1)質(zhì)量濃度為10 g/L、L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為30 g/L、檸檬酸三胺質(zhì)量濃度為2 g/L、K2HPO4質(zhì)量濃度為2 g/L 、乙酸鈉質(zhì)量濃度為5 g/L、硫酸鎂質(zhì)量濃度為0.1 g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度為0.05 g/L、吐溫80體積比為1 mL/L。此時(shí)，L.plantarumMJ0301產(chǎn)GABA的質(zhì)量濃度為1.59 g/L[13]。也有一些研究者對(duì)乳酸菌在天然培養(yǎng)基中的γ-氨基丁酸的產(chǎn)量進(jìn)行了報(bào)道。如SONG等[14]研究了L.rhamnosusGG赤豆乳中產(chǎn)γ-氨基丁酸的情況(干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)，添加了1.44%半乳糖， 2.27% L-谷氨酸鈉和0.20%維生素B6，以1%的接種量(種子液的菌數(shù)為108CFU/mL)，37℃，培養(yǎng)36 h的條件下，γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度為1.12 mg/mL。L.brevisBJ20海帶提取物發(fā)酵液中，γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度為2.465 mg/L[15]。高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌不僅與它們的GAD活性有關(guān)，而且與食物基質(zhì)中谷氨酸、GAD輔酶(磷酸吡哆醛)的濃度有關(guān)[15]，高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌有開發(fā)功能性食品的潛力。

目前，多數(shù)對(duì)乳酸菌GABA產(chǎn)量?jī)?yōu)化的研究主要從增強(qiáng)GAD活性入手，其中重要的影響因素有底物谷氨酸或谷氨酸鹽的濃度、接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、環(huán)境pH值和發(fā)酵基質(zhì)等。在本研究預(yù)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)外源添加的L-谷氨酸鈉對(duì)發(fā)酵體系的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度沒有影響，可能是由于豆芽乳本身含有的谷氨酸對(duì)于植物乳桿菌來說已經(jīng)足量。GABA常在乳酸菌發(fā)酵的穩(wěn)定后期達(dá)到最大值，發(fā)酵終點(diǎn)的酸度和營(yíng)養(yǎng)匱乏程度影響到GABA的產(chǎn)量[16]。在特定發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，接種量的變化會(huì)影響穩(wěn)定后期的發(fā)酵參數(shù)，從而影響GABA的產(chǎn)量。GAD酶的含量和活力會(huì)直接影響GABA的產(chǎn)量。在發(fā)酵時(shí)間單因素優(yōu)化試驗(yàn)中，0～24 h范圍內(nèi)，隨著菌體量的增多，GAD的質(zhì)量濃度不斷增加，發(fā)酵乳pH值逐漸偏酸性，而乳酸菌GAD的最適pH值是偏酸性的，因此，GABA質(zhì)量濃度不斷增加。在發(fā)酵24 h后，GABA質(zhì)量濃度開始下降，這可能是由于發(fā)酵體系的pH值不再適合谷氨酸脫羧酶的活性范圍，乳酸菌GABA-T活性增加了GABA分解代謝的作用；另一方面外界環(huán)境刺激時(shí)，GABA的產(chǎn)生是細(xì)菌的一種自我防護(hù)機(jī)制，用來緩解壓力和提高細(xì)菌存活力[17]。在延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間的情況下，乳酸菌代謝產(chǎn)生GABA可能作為能量來源被消耗[18]。發(fā)酵溫度不僅影響GAD的催化活性，同時(shí)影響菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖，因此發(fā)酵溫度也是影響乳酸菌發(fā)酵過程中GABA積累量的關(guān)鍵因素。由于不同乳酸菌中GAD的性質(zhì)不同，所以GABA最大積累時(shí)發(fā)酵溫度具有種屬特異性。一般來說，乳酸菌GAD的最適pH值是偏酸性的，最適溫度在30～37℃的范圍內(nèi)。CHOI等[19]對(duì)一株乳酸短桿菌產(chǎn)GABA的發(fā)酵條件進(jìn)行初步優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度為32℃時(shí)，該乳酸短桿菌合成GABA的量最大[19]。L.brevisGABA057能在高酸性的環(huán)境下(pH值約為4.2)將10%的底物轉(zhuǎn)化成GABA[20]，然而此時(shí)的酸性環(huán)境已經(jīng)不適宜菌體的生長(zhǎng)。

L.plantarum能夠耐胃酸和膽汁消化，黏附并定植于宿主腸道上皮細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮多種有助于宿主健康的益生功能，因此常作為益生菌應(yīng)用于發(fā)酵食品和保健品中。利用植物乳桿菌發(fā)酵果蔬，改善果蔬中活性成分組成，開發(fā)功能性飲品的研究已十分廣泛[21]。L.plantarum能夠利用谷氨酸或其鹽類，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生GABA是其諸多生理功能中的重要一項(xiàng)。在大豆發(fā)芽過程中，蛋白質(zhì)和氨基酸含量都有顯著的變化，大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得以提高。發(fā)芽本身還可以去除部分“豆腥味” ，發(fā)芽不僅會(huì)使豆乳變得更益于人類健康，而且可能會(huì)促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵和γ-氨基丁酸的產(chǎn)生。 胡東良等[22]研究了乳酸菌豆芽乳發(fā)酵特性，結(jié)果表明， 乳酸菌在豆芽乳中生長(zhǎng)良好，使豆芽乳pH值下降， 產(chǎn)生凝乳作用。崔蕊靜等[23]采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵豆芽乳，制成的酸豆奶風(fēng)味獨(dú)特，富有清香味，營(yíng)養(yǎng)豐富，色澤近似酸牛奶，是一種優(yōu)良的功能性乳制品。這也證明了開發(fā)富含γ-氨基丁酸的乳酸菌發(fā)酵豆芽乳，有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4　結(jié)論

(1)研究了接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)豆芽乳發(fā)酵體系中γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用CCD 設(shè)計(jì)，以γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，利用Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出發(fā)酵體系模型，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。在此模型中，各因素對(duì)發(fā)酵乳的γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度均有顯著的影響。且發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度之間的交互作用極顯著(P<0.01)，植物乳桿菌接種量與發(fā)酵溫度、植物乳桿菌接種量與發(fā)酵時(shí)間之間的交互作用顯著(P<0.05)。發(fā)酵體系的最佳工藝條件是接種量3.5%、發(fā)酵時(shí)間27 h、發(fā)酵溫度34.5℃。在此條件下γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度預(yù)測(cè)值為1.62 g/L，試驗(yàn)驗(yàn)證值為1.61 g/L。

(2)豆芽發(fā)酵乳凝固狀態(tài)均勻，乳清析出少，且有濃郁的發(fā)酵豆乳味香，風(fēng)味純正，無(wú)異味，發(fā)酵乳的pH 值為4.6，最大活菌數(shù)為1.60×109CFU/mL。在4℃條件下貯藏1～3 d內(nèi)，品質(zhì)基本無(wú)變化，各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)良。1～7 d內(nèi)綜合品質(zhì)達(dá)標(biāo)。可見通過響應(yīng)面優(yōu)化法與模型的建立得到的發(fā)酵體系最佳工藝條件對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

1IMAM M U, MUSA S N, AZMI N H, et al. Effects of white rice, brown rice and germinated brown rice on antioxidant status of type 2 diabetic rats[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(10): 12952-12969.

2YOSHIMURA M, TOYOSHI T, SANO A, et al. Antihypertensive effect of a γ-aminobutyric acid rich tomato cultivar ‘DG03-9’ in spontaneously hypertensive rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(1): 615-619.

3PARK K B, OH S H. Production and characterization of GABA rice yogurt[J]. Food Science & Biotechnology, 2005, 14(4): 518-522.

4SIRAGUSA S, DE A M, DI C R, et al．Synthesis of y-aminobutyric acid by lactic acid bacteria isolated from a variety of Italian cheeses[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73(22)：7283-7290.

5LACROIX N, ST-GELAIS D, CHAMPAGNE C P, et al. Gamma-aminobutyric acid-producing abilities of lactococcal strains isolated from old-style cheese starters[J]. Dairy Science & Technology, 2013, 93(3): 315-327.

6MBITHI S, CAMP J V, RODRIGUEZ R, et al. Effects of sprouting on nutrient and antinutrient composition of kidney beans (Phaseolusvulgarisvar. Rose coco)[J]. European Food Research & Technology, 2001, 212(2):188-191.

7許建軍, 江波, 許時(shí)嬰. 谷氨酸脫羧酶的分離純化及部分酶學(xué)性質(zhì)[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 23(3): 79-83.

XU J J, JIANG B, XU S Y. Purification and partial characterization of glutamate decarboxylase fromLactococcuslactis[J]. Journal of Wuxi University of Light Industry, 2004, 23(3): 79-83.(in Chinese)

8渠巖, 李平蘭, 王夫杰，等. 發(fā)酵食品中產(chǎn)γ-氨基丁酸植物乳桿菌S35的篩選鑒定[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 15(5):104-109.

QU Y, LI P L, WANG F J, et al. Screening and identification of γ-amino butyric acid-producingLactobacillusplantarumS35 from fermented food[J]. Journal of China Agricultural University, 2010, 15(5):104-109.(in Chinese)

9陳璐. 酸豆奶穩(wěn)定性研究及配方設(shè)計(jì)[D]. 長(zhǎng)春：吉林大學(xué), 2013.

CHEN L. Studies on stability and formula design of the fermented soy-milk[D]. Changchun: Jilin University, 2013.(in Chinese)

10張莉力，許云賀. 培養(yǎng)條件對(duì)大豆芽中γ- 氨基丁酸含量的影響[J].食品科技, 2008,33(2):34-35.

ZHANG L L, XU Y H. Effect of cultivation on the production of γ-amino butyric acid in soybean sprouts[J]. Food Science & Technology, 2008, 33(2): 34-35.(in Chinese)

11KOOK M C, SEO M J, CHEIGH C I, et al. Enhancement of γ-amminobutyric acid production byLactobacillussakeiB2-16 expressing glutamate decarboxylase fromLactobacillusplantarumATCC 14917[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2010, 53(6): 816-820.

12李理. 植物乳桿菌γ-氨基丁酸產(chǎn)量影響因素及代謝途徑的研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

LI L. Study on influence factors and metabolic pathways of gamma-aminobutyric acid inLactobacillusplantarum[D]. Harbin: Northeast Agricultural University, 2015.(in Chinese)

13黃桂東, 毛健, 姬中偉，等. 一株產(chǎn)γ-氨基丁酸植物乳桿菌MJ0301培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(17): 165-170.

HUANG G D, MAO J, JI Z W, et al. Optimization of culture medium formulation for γ-aminobutyric acid-producingLactobacillusplantarumMJ0301[J]. Food Science, 2013, 34(17): 165-170.(in Chinese)

14SONG H Y, YU R C. Optimization of culture conditions for gamma-aminobutyric acid production in fermented adzuki bean milk[J]. Journal of Food & Drug Analysis, 2017, 26(1): 1-8.

15BAEJIN L, JINSOO K, KANG Y M, et al. Antioxidant activity and γ-aminobutyric acid (GABA) content in sea tangle fermented byLactobacillusbrevisBJ20 isolated from traditional fermented foods[J]. Food Chemistry, 2010, 122(1): 271-276.

16DI C R, MAZZACANE F, RIZZELLO C G, et al. Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) byLactobacillusplantarumDSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2010, 86(2): 731-741.

17COTTER P D, HILL C. Surviving the acid test: responses of gram-positive bacteria to low pH[J]. Microbiology & Molecular Biology Reviews, 2003, 67(3):429-453.

18KO C Y, LIN H T V, TSAI G J . Gamma-aminobutyric acid production in black soybean milk byLactobacillusbrevisFPA 3709 and the antidepressant effect of the fermented product on a forced swimming rat model[J].Process Biochemistry, 2013, 48(4): 559-568.

19CHOI S I, LEE J W, PARK S M, et al．Improvement of γ-aminobutyric acid(GABA) production using cell entrapment ofLactobacillusbrevisGABA 057[J]．Journal of Microbiology and Biotechnology，2006，16(4)：562-568．

20PENG C, HUANG J, SHENG H U, et al. A two-stage pH and temperature control with substrate feeding strategy for production of gamma-aminobutyric acid byLactobacillusbrevisCGMCC 1306[J]. Chinese Journal of Chemical Engineering，2013, 21(10): 1190-1194.

21賴婷, 張名位, 劉磊,等. 龍眼果漿復(fù)合乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2016, 32(增刊2):390-397.

LAI T, ZHANG M W, LIU L, et al. Optimization of process conditions of dry longan pulp fermented by complex lactic acid bacteria[J]. Transactions of the CSAE, 2016, 32(Supp.2): 390-397.(in Chinese)

22胡東良, 馬鐵俊, 王立梅，等. 乳酸菌豆芽乳發(fā)酵特性的研究[J]. 食品科學(xué), 1994, 15(12): 8-12.

HU D L, MA T J, WANG L M, et al. Fermentation characteristics of lactic acid bacteria for the production of a germinated soybean-based fermented milk [J]. Food Science, 1994, 15(12): 8-12.(in Chinese)

23崔蕊靜, 肖念新, 杜彬. 發(fā)酵豆芽乳飲料加工工藝條件優(yōu)化[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2009, 24(4):138-143.

CUI R J, XIAO N X, DU B. Preparation of fermented bean sprout milk drink[J]. Journal of the Chinese Cereals & Oils Association, 2009, 24(4):138-143.(in Chinese)