基于免疫組織化學法分析基質(zhì)金屬蛋白酶2在喉鱗狀細胞癌中表達及意義的Meta分析△

黃強　周梁

喉癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤之一，且隨著生活環(huán)境以及生活方式的改變，發(fā)病率有逐年上升趨勢[1]，也是唯一一個5年生存率不升反降的腫瘤類型[2]。吸煙、飲酒的人群罹患喉癌的風險比不吸煙、不飲酒的人群高數(shù)倍[3]。喉癌早期癥狀隱匿，發(fā)現(xiàn)時60%的患者已進入進展期[1]，故早期診斷和治療喉癌是臨床的重中之重。相關(guān)研究[4]表明：基質(zhì)金屬蛋白酶2(metal matrix proteinase-2, MMP-2)介導喉癌細胞的間質(zhì)遷移以及浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為，在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。本研究系統(tǒng)評價MMP-2在喉癌中的表達及其臨床意義，以期能給基礎(chǔ)和臨床研究提供證據(jù)支撐。

1　資料與方法

1.1檢索策略通過中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方、維普、Pubmed、Web of science等國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫以“基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、明膠酶2(matrix metalloproteinase-2)、喉癌(laryngeal carcinoma)、喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)、喉腫瘤(laryngeal cancer)”等檢索詞進行計算機檢索，收集關(guān)于MMP-2在喉癌中表達及其意義的文獻，時間跨度為建庫后到2017年1月，輔以手工檢索參考文獻。

1.2納入標準①國內(nèi)外公開發(fā)表的關(guān)于MMP-2在喉癌中表達情況的病例-對照研究；②腫瘤組標本必須經(jīng)病理驗證為LSCC，對照組標本為非腫瘤組織，包括正常黏膜、聲帶息肉以及癌旁安全緣組織；③所有喉癌患者之前未接受任何放、化療以及生物治療等措施；④檢測方法為免疫組織化學SP(streptavidin-perosidase)法；⑤原始文獻中可提取出優(yōu)勢比(odd ratio,OR)值和95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)，或者可通過推導得出。

1.3排除標準①無對照組或者對照組為癌前病變樣本；②樣本含非LSCC以及喉轉(zhuǎn)移癌；③Western印跡等其他檢測方法或非免疫組織化學SP法；④無免疫組織化學結(jié)果評判標準；⑤綜述、會議論文等文獻；⑥推導不出數(shù)據(jù)以及數(shù)據(jù)信息過少的文獻；⑦重復發(fā)表的文獻。

1.4篩選、質(zhì)量評價、數(shù)據(jù)提取由2名研究者根據(jù)檢索策略以及納入、排除標準獨立進行文獻檢索，根據(jù)Lichtenstein質(zhì)量評價表[5]進行質(zhì)量評價。①是否明確納入標準及其基本特征；②是否科學地設(shè)計試驗；③是否正確處理相關(guān)因素及方法；④是否正確使用統(tǒng)計方法；⑤是否就存在的偏倚進行討論。以上5項指標，每項為1分，滿足總分≥3分者認為文獻質(zhì)量可靠。進行數(shù)據(jù)提取、整理。主要指標為MMP-2在腫瘤組織以及對照組中的表達差異，次要指標包括MMP-2在喉癌不同臨床分期、TNM分期、病理分級、原發(fā)位置以及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移之間的差異。有分歧時由2名研究者

通過討論解決問題，意見不一致的由第三方評定。

1.5統(tǒng)計學處理采用從Cochrane協(xié)作網(wǎng)下載的Review manager 5.3軟件按照Meta分析的要求對結(jié)局指標進行合并分析并繪制出森林圖，采用OR值及95%CI為分析統(tǒng)計量，檢驗水平為P=0.05。25%≤I2<50%為存在輕度異質(zhì)性，50%≤I2<75%為存在中度異質(zhì)性，I2≥75%為存在重度異質(zhì)性。各研究結(jié)果間存在異質(zhì)性差異時(P≤0.10，I2≥25%)采用隨機效應(yīng)模型，無異質(zhì)性差異時則采用固定效應(yīng)模型(P>0.10，I2<25%)。

2　結(jié)果

2.1文獻檢索結(jié)果聯(lián)機以及手工檢索共獲得相關(guān)文獻122篇，根據(jù)文獻的納入、排除標準，閱讀摘要排除內(nèi)容不相關(guān)文獻80篇，重復發(fā)表或綜述6篇，閱讀全文排除無對照組或?qū)φ战M不符要求11篇，樣本含非LSCC及喉轉(zhuǎn)移癌3篇，非免疫組織化學SP法檢測13篇。共納入符合標準的文獻9篇[6-14]，其中LSCC組樣本共473例，對照組樣本共245例(圖1)。

圖1.　文獻篩選流程圖

2.2入選文獻的基本特征納入研究的9篇文獻質(zhì)量都較高，包含了LSCC組與對照組MMP-2表達水平的比較以及MMP-2在LSCC淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移之間的原始數(shù)據(jù)；5篇涉及MMP-2在LSCC不同臨床分期之間的差異比較；4篇涉及MMP-2在LSCC不同TNM分期中的變化；7篇涉及MMP-2在LSCC不同病理分級表達情況的比較；3篇涉及MMP-2在LSCC不同原發(fā)位置的表達差異。文獻質(zhì)量評價詳情、基本特征見表1、2。

表1　Lichtenstein質(zhì)量評價表

表2　納入研究的基本特征(MMP-2表達陽性率)

注：“/”表示無此項

2.3MMP-2表達結(jié)果分析

2.3.1MMP-2在LSCC組與對照組中的表達有關(guān)MMP-2在LSCC組和對照組中的研究共納入9篇文獻，其中LSCC組中MMP-2表達陽性者359例(75.90%)，對照組中MMP-2表達陽性者67例(27.35%)。各項研究間存在中度異質(zhì)性(P=0.03，I2=54%)，因此選用隨機效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：LSCC組和對照組在MMP-2表達水平上的差異具有明顯統(tǒng)計學意義[OR=8.88，95%CI：5.04～15.63，P<0.05](圖2)。

圖2.　MMP-2在LSCC組與對照組中的表達情況

2.3.2MMP-2在LSCC不同臨床分期中的表達關(guān)于MMP-2在LSCC不同臨床分期中的研究共納入5篇文獻，其中Ⅰ～Ⅱ期MMP-2表達陽性者56例(68.29%)，Ⅲ～Ⅳ期MMP-2表達陽性者111例(85.38%)。各項研究之間不存在異質(zhì)性(P=0.50，I2=0)，據(jù)此選用固定效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：LSCC不同臨床分期中MMP-2的表達水平差異具有明顯統(tǒng)計學意義[OR=2.76，95%CI：1.39～5.51，P<0.05](圖3)。

圖3.　MMP-2在LSCC不同臨床分期中的表達情況

2.3.3MMP-2在LSCC不同TNM分期中的表達關(guān)于MMP-2在LSCC不同TNM分期中的研究共納入4篇文獻，其中T1～T2期MMP-2表達陽性者52例(61.90%)，T3～T4期MMP-2表達陽性者95例(83.33%)。各項研究之間不存在異質(zhì)性(P=0.45，I2=0)，據(jù)此選用固定效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：LSCC不同TNM分期中MMP-2的表達水平差異具有明顯統(tǒng)計學意義[OR=3.46，95%CI：1.72～6.96，P<0.05](圖4)。

圖4.　MMP-2在LSCC不同TNM分期中的表達情況

2.3.4MMP-2在LSCC有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達關(guān)于MMP-2在LSCC有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的研究共納入9篇文獻，其中淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組MMP-2表達陽性者190例(87.16%)，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組MMP-2表達陽性者169例(66.27%)。各項研究之間存在中度異質(zhì)性(P=0.007，I2=62%)，因此選用隨機效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：MMP-2在LSCC淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移的表達水平上差異具有明顯統(tǒng)計學意義[OR=4.07，95%CI：1.60～10.32，P<0.05](圖5)。

圖5.　MMP-2在LSCC有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達情況

2.3.5MMP-2在LSCC不同病理分級中的表達關(guān)于MMP-2在LSCC不同病理分級中的研究共納入7篇文獻，其中中低分化組MMP-2表達陽性者189例(83.26%)，高分化組MMP-2表達陽性者87例(64.93%)。各項研究之間存在輕度異質(zhì)性(P=0.08，I2=46%)，因此選用隨機效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：MMP-2在LSCC不同病理分級的表達水平上的差異具有統(tǒng)計學意義[OR=3.04，95%CI：1.35～6.85，P<0.05](圖6)。

圖6.　MMP-2在LSCC不同病理分級中的表達情況

2.3.6MMP-2在LSCC不同原發(fā)位置中的表達關(guān)于MMP-2在LSCC不同原發(fā)位置中的研究共納入3篇文獻，其中聲門型組MMP-2表達陽性者68例(74.73%)，非聲門型組MMP-2表達陽性者54例(72.97%)。各項研究之間存在中度異質(zhì)性(P=0.14，I2=50%)，因此選用隨機效應(yīng)模型進行分析。結(jié)果顯示：MMP-2在LSCC不同原發(fā)位置的表達水平上的差異并不具有明顯統(tǒng)計學意義[OR=1.10，95%CI：0.38～3.13，P=0.86](圖7)。

圖7.　MMP-2在LSCC不同原發(fā)位置中的表達情況

2.4發(fā)表偏倚通過繪制倒漏斗圖(圖8)發(fā)現(xiàn)所有研究呈倒漏斗狀排列，但并不完全對稱分布。不能排除存在發(fā)表偏倚的可能，需進一步做敏感度分析以驗證結(jié)論是否穩(wěn)健。

圖8.　LSCC組和對照組MMP-2表達差異的倒漏斗圖

2.5敏感度分析本文研究的主要指標是MMP-2在LSCC組和對照組的表達情況，次要指標是MMP-2在LSCC淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移以及不同病理分級中的表達情況，均有不同程度的異質(zhì)性差異，因此有必要進行敏感度分析以檢驗這3項指標的結(jié)論是否受異質(zhì)性差異的影響。通過逐篇剔除納入的文獻，發(fā)現(xiàn)這3項指標的結(jié)論并沒有發(fā)生改變，差異仍然具有統(tǒng)計學意義[OR=8.88，95%CI：5.04～15.63，P<0.05；OR=4.07，95%CI:1.60～10.32，P<0.05；OR=3.04，95%CI:1.35～6.85，P<0.05]。同時通過Stata 13.1軟件進行敏感度分析驗證，結(jié)果顯示：納入的效應(yīng)值基本上在總效應(yīng)值的可信區(qū)間之內(nèi)(圖9～11)，提示異質(zhì)性差異的存在并沒有影響這3項指標結(jié)論的穩(wěn)定性，結(jié)果較穩(wěn)健。

圖9.　MMP-2在LSCC組和對照組表達差異的敏感度分析

圖10.　MMP-2在LSCC淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移中表達差異的敏感度分析

圖11.　MMP-2在不同病理分級中表達差異的敏感度分析

3　討論

Meta分析是整合分析眾多具有特定條件研究的一種方法，通過Meta分析可以將眾多小樣本研究整合在一起，達到擴大樣本含量增強檢驗效能的目的，因此在臨床研究和醫(yī)療決策中扮演重要的角色。本研究利用Meta分析研究MMP-2在LSCC中的表達及其臨床意義，為了驗證結(jié)論是否穩(wěn)健以及是否受到發(fā)表偏倚等影響，通過倒漏斗圖繪制驗證，逐篇剔除納入文獻以及利用Stata 13.1軟件進行敏感度驗證，均提示即使納入的相關(guān)文獻存在一定的異質(zhì)性以及發(fā)表偏倚，但結(jié)論仍然具有統(tǒng)計學意義，結(jié)果可靠。但是受到陰性結(jié)果不發(fā)表、文獻語種限制、樣本量、實驗方法和納入文獻條件限制等問題，不可避免地存在各種偏倚，在一定程度上也會影響Meta分析的結(jié)果，因此尚需增加樣本量及優(yōu)化方案以進一步驗證。

浸潤、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤區(qū)別于良性病變的最顯著特征，亦是造成臨床治療失敗的主要原因之一。MMPs超家族是一組高度同源的蛋白酶類，主要包括MMP-2和MMP-9，參與降解、破壞構(gòu)成細胞外基質(zhì)的Ⅳ型膠原，而Ⅳ型膠原則是構(gòu)成基底膜的重要組成成分[15]。MMPs超家族(包括MMP-2和MMP-9)以酶原形式分泌，在生理條件下參與胚胎發(fā)育、組織重塑等過程，但在某些病理條件下被金屬蛋白酶組織抑制因子2(TIMP-2)招募到細胞表面激活而參與炎癥以及腫瘤轉(zhuǎn)移的過程[16]?；啄な翘峁┘毎Y(jié)構(gòu)支撐、營養(yǎng)等的重要結(jié)構(gòu)，也是阻止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要屏障，其病理性的降解可導致腫瘤細胞沿著基底膜缺口向間質(zhì)遷移、促進腫瘤細胞從原發(fā)部位脫落向遠處轉(zhuǎn)移[17]，因此與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。最近有研究[18]發(fā)現(xiàn)：膽管癌細胞可通過下調(diào)miR-138的表達水平增強MMP-2和MMP-9的表達，從而使其增殖遷移以及侵襲能力得到加強。而在人骨肉瘤細胞中，腫瘤細胞產(chǎn)生的結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)通過下調(diào)miR-519d的表達水平增強了MMP的表達，從而促進了腫瘤的轉(zhuǎn)移[19]。Xu等[20]采用葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1(glucose transporter protein-1, Glut-1)反義核酸技術(shù)轉(zhuǎn)染LSCC細胞系Hep-2，發(fā)現(xiàn)與腫瘤惡性行為密切相關(guān)的Glut-1與MMP-2共表達，且Glut-1參與調(diào)控MMP-2的表達。這提示在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中，調(diào)控MMP表達水平的基因及機制極為復雜，共同參與了對細胞外基質(zhì)的降解，從而促進了腫瘤細胞的生長和侵襲能力。

本研究通過Meta分析發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達在LSCC組織中增加。林雁等[10]分析了MMP-2在54例腫瘤組織、23例聲帶息肉組織和15例喉部正常組織的表達水平，發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達在腫瘤組織的表達水平(72.2%)高于息肉組織(47.8%)和喉部正常組織(40%)，推測MMP-2的表達與臨床分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度存在相關(guān)性。這與Gou等[21]發(fā)現(xiàn)MMP-2在LSCC組織中高表達，且MMP-2的高表達水平是導致LSCC患者預(yù)后較差的因素結(jié)果一致。另外本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-2表達水平在臨床分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化等方面具有緊密的相關(guān)性，均提示MMP-2在LSCC的發(fā)生、發(fā)展、演化中具有重要意義。而MMP-2在LSCC不同原發(fā)部位差異并不顯著的原因，推測可能是由于不同原發(fā)部位的腫瘤產(chǎn)生MMP-2的量無顯著差別所致

總之，本研究采用Meta分析發(fā)現(xiàn)MMP-2在LSCC組織中的表達增高，且與腫瘤進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化存在相關(guān)性。MMP-2的表達水平改變可能在LSCC的早期診斷和治療等方面具有重要意義。隨著MMP-2的致癌機制以及在LSCC浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后中具體作用的深入研究，特異性地抑制MMP-2也可能成為一種潛在的LSCC靶向治療策略。

[ 1 ]Steuer CE, El-Deiry M, Parks JR, et al. An update on larynx cancer[J]. CA Cancer J Clin, 2017,67(1):31-50.

[ 2 ]Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(1):7-30

[ 3 ]Bosetti C, Gallus S, Franceschi S, et al. Cancer of the larynx in non-smoking alcohol drinkers and in non-drinking tobacco smokers[J]. Br J Cancer, 2002,87(5):516-518.

[ 4 ]Uloza V, Liutkevicius V, Pangonyte D, et al. Characteristics of expression of matrix metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9) in glottic squamous cell carcinoma and benign vocal fold lesions[J]. Clin Exp Otorhinolaryngol, 2015,8(1):57.

[ 5 ]Lichtenstein MJ, Mulrow CD, Elwood PC. Guidelines for reading case-control studies[J]. J Chronic Dis, 1987,40(9):893-903.

[ 6 ]韓鳳艷, 劉愛東. 喉鱗癌中claudin-1、MMP-2和E-cadherin的表達及意義[J]. 中國誤診學雜志, 2010,10(7):1544-1545.

[ 7 ]吳正虎, 曹曉林, 徐如君, 等. Ⅳ型膠原、Ⅳ型膠原酶及TIMP-1在喉癌組織中的表達[J]. 浙江醫(yī)學, 2003,25(3):6-8.

[ 8 ]Cao XL, Xu RJ, Zheng YY, et al. Expression of type IV collagen, metalloproteinase-2, metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in laryngeal squamous cell carcinomas[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2011,12(12):3245-3249.

[ 9 ]許燕飛, 馮青杰, 滕博, 等. 喉鱗狀細胞癌組織中Galectin-3表達與Bcl-2、Mmp-2及K-ras表達的相關(guān)性分析[J]. 吉林大學學報(醫(yī)學版), 2011,37(6):1116-1119.

[10]林雁, 尹芳, 袁瑩, 等. 基質(zhì)金屬蛋白酶-2和血管內(nèi)皮生長因子在喉癌中的表達及意義[J]. 重慶醫(yī)學, 2014,15(16):1972-1974.

[11]王曉茜, 山艷春, 王繼群, 等. 基質(zhì)金屬蛋白酶-2在喉鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義[J]. 臨床耳鼻咽喉科雜志, 2006,20(24):1109-1110.

[12]馬儉, 喬宗海, 吳四海. 基質(zhì)金屬蛋白酶和細胞黏附因子CD147在喉鱗狀細胞癌中的表達[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 2004,39(9):61-62.

[13]胡向陽, 邱建新, 吳強, 等. 明膠酶及腫瘤抑制基因pten在喉鱗狀細胞癌中表達的研究[J]. 中國組織化學與細胞化學雜志, 2004,13(3):290-295.

[14]孫樹軍, 劉清明, 田軍, 等. 聲門上型喉鱗狀細胞癌組織VEGF、MMP-2、eIF4E的表達及臨床意義[J]. 中國耳鼻咽喉顱底外科雜志, 2007,13(5):332-336.

[15]孫亞男, 李源, 謝民強, 等. 基質(zhì)金屬蛋白酶的表達與聲門上喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 2004,39(11):55-57.

[16]Mook OR, Frederiks WM, Van Noorden CJ. The role of gelatinases in colorectal cancer progression and metastasis[J]. Biochim Biophys Acta, 2004,1705(2):69-89.

[17]Jacob A, Prekeris R. The regulation of MMP targeting to invadopodia during cancer metastasis[J]. Front Cell Dev Biol, 2015,3:4.

[18]Wang Q, Tang H, Yin S, et al. Downregulation of microRNA-138 enhances the proliferation, migration and invasion of cholangiocarcinoma cells through the upregulation of RhoC/p-ERK/MMP-2/MMP-9[J]. Oncol Rep, 2013,29(5):2046-2052.

[19]Tsai HC, Su HL, Huang CY, et al. CTGF increases matrix metalloproteinases expression and subsequently promotes tumor metastasis in human osteosarcoma through down-regulating miR-519d[J]. Oncotarget, 2014,5(11):3800-3812.

[20]Xu YY, Bao YY, Zhou SH, et al. Effect on the expression of MMP-2, MT-MMP in laryngeal carcinoma Hep-2 cell line by antisense glucose transporter-1[J]. Arch Med Res, 2012,43(5):395-401.

[21]Gou X, Chen H, Jin F, et al. Expressions of CD147, MMP-2 and MMP-9 in laryngeal carcinoma and its correlation with poor prognosis[J]. Pathol Oncol Res, 2014,20(2):475-481.