基于Miseq測序技術(shù)分析不同元胡產(chǎn)區(qū)土壤細(xì)菌功能基因組成與差異

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

元胡（Corydalis yanhusuo,C.yanhusuo）又名延胡索、玄胡，是浙江道地藥材“浙八味”之一，為罌粟科植物延胡索的干燥塊莖，具有活血、行氣、止痛之功效[1]。元胡療效與其多重成分的不同結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相關(guān)，其主要藥效成分為生物堿，包括巴馬汀、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素等[2]。文獻(xiàn)報(bào)道延胡索生物堿對治療心肌缺血、促進(jìn)血液循環(huán)、減輕疼痛均有一定療效[3-5]。在我國，元胡主要分布在安徽、河南、浙江、陜西等地，近年來除了以浙江金華為代表的元胡道地產(chǎn)區(qū)外，還形成了以陜西漢中為代表的新產(chǎn)區(qū)。陜西產(chǎn)區(qū)的元胡產(chǎn)量甚至有趕超道地產(chǎn)區(qū)的趨勢，僅漢中市城固縣一地，元胡種植面積就占全國種植總面積的65%[6]。

道地藥材是傳統(tǒng)的、公認(rèn)的、且來源于特定產(chǎn)地的名優(yōu)正品藥材，是中藥材精粹之所在，也是歷代醫(yī)家防病治病最有力的武器之一。中藥材向來注重道地性，道地藥材研究關(guān)系到中醫(yī)藥現(xiàn)代化與國際化進(jìn)程[7-8]。然而，為了滿足不斷擴(kuò)大的臨床需求，很多藥材已模糊了道地產(chǎn)區(qū)的概念，種植已擴(kuò)大到道地產(chǎn)區(qū)以外[9]。這種非道地產(chǎn)區(qū)的大量種植模糊了道地藥材的優(yōu)勢，對道地藥材造成較大的沖擊和影響。事實(shí)上，道地產(chǎn)區(qū)的形成與植物、土壤和根際微生物構(gòu)建成的土壤微生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)，根際微生物與植物根際形成寄主-宿主模式互相影響和作用。在中藥種植栽培研究過程中發(fā)現(xiàn)，土壤微生物在土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化循環(huán)、系統(tǒng)穩(wěn)定性、抗干擾能力以及可持續(xù)利用中占據(jù)主導(dǎo)地位[10]。例如，杭白芍芍藥苷與根際細(xì)菌多樣性相關(guān)[11]；不同浙貝母種源決定根際真菌多樣性，微生物又會反過來影響貝母生長[12]。元胡的性狀和化學(xué)成分也可因產(chǎn)地不同而存在明顯差異，而導(dǎo)致品質(zhì)差異的諸多原因中，土壤微生物的作用不容忽視。

本研究采用Miseq測序技術(shù)，在對土壤細(xì)菌進(jìn)行16s測序分析多樣性和組成的同時(shí)，通過獲得的根際土壤中微生物構(gòu)成推測其功能基因的構(gòu)成[13-14]，并與COG和KEGG數(shù)據(jù)庫比對，分析元胡道地產(chǎn)區(qū)和非道地產(chǎn)區(qū)間根際土壤細(xì)菌組成及與功能基因的差異，旨在從根際微生物的基因水平探討根際細(xì)菌對元胡生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集 選取元胡新產(chǎn)區(qū)陜西漢中市的特色實(shí)驗(yàn)基地，分別為陜西一（陜西南鄭）、陜西二（漢中上元觀）、陜西三（陜西董家營），以及元胡道地產(chǎn)區(qū)實(shí)驗(yàn)基地，分別為浙江一（浙江東陽）、浙江二（浙江磐安）、浙江三（浙江仙居），同時(shí)播種元胡種子，每組10株，每個(gè)處理重復(fù)3次。待元胡成熟后，五點(diǎn)采樣法同時(shí)采收元胡塊莖及根際土。塊莖用自來水洗凈，吸干水分后稱鮮重并測量粒徑，日曬至恒重后測干重并打粉，置于硅膠干燥器中備用，收集元胡根際土（粘附于元胡塊莖周圍2cm范圍內(nèi)定義為根際土）500g，重復(fù)3次，過20目篩去除石塊以及動植物殘?bào)w后裝入密封袋中，放入冰盒中保存，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃冰箱保存。

1.2 土壤總基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及Miseq測序 土壤樣品預(yù)處理后，利用E.Z.N.A.Soil DNA Kit（Omega公司產(chǎn)品，批號：00M5635020000C02Q003）進(jìn)行土壤總基因組DNA提取，具體方法詳見E.Z.N.A Soil DNA Kit的試劑盒使用說明書，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒（Life公司產(chǎn)品，批號：1759393）對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)中應(yīng)加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合Miseq測序平臺的V3-V4通用引物，其中341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG；805R 引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATC。所有引物均由上海生工生物工程公司合成。第一輪PCR：94℃預(yù)變性3min，前5個(gè)循環(huán)，94℃變性 30s，45℃退火 20s，65℃延伸 30s；后20 個(gè)循環(huán)，94℃變性 20s，55℃退火 20s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。第二輪擴(kuò)增過程引入Illumina橋式PCR兼容引物，95℃預(yù)變性30s，共5個(gè)循環(huán)，94℃變性 20s，55℃退火 20s，72℃延伸 30s，最后72℃延伸5min。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。選用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）對DNA純化回收，利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量。每個(gè)樣品DNA量取10ng，上機(jī)進(jìn)行Miseq測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理 Illumina MiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別（base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（sequenced reads）。去除引物接頭序列，再根據(jù)配對末端（paired-end，PE）reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。再去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列后，利用PICRUSt進(jìn)行功能預(yù)測分析，根據(jù)功能分類豐度，繪制功能分類條形圖、豐度熱圖、豐度柱狀圖、豐度聚類樹圖，并進(jìn)行PCA/NMDS分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 根據(jù)功能分類豐度在樣本之間的差異，利用STAMP統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)篩選樣本組間的差異功能分類單元，采用方法為Welch’s t-test。最后將檢驗(yàn)得到的P值采用FDR做Multiple test correction得到Q值。其余數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料均以±s表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測序長度分析 結(jié)果如圖1所示，A為原始序列使用pear融合后的序列長度，以及該長度reads數(shù)目，長度在440～480bp區(qū)間；B為質(zhì)控(去除barcode、primer以及部分低質(zhì)量序列)后的序列長度，以及該長度reads數(shù)目，長度在380～440bp區(qū)間。符合大部分微生物種類16S第三區(qū)（V3）及第四區(qū)（V4）長度。在97%的相似水平下，共檢測操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）數(shù)目 141 868 個(gè)，所有樣品中檢測出OTU數(shù)目99 843個(gè)。

圖1 測序長度分布圖Fig.1 The length distribution of sequence

2.2 不同產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)比較通過Miseq測序技術(shù)，對元胡根際細(xì)菌在分類水平上進(jìn)行檢測，共檢測到42門、82綱、106目、235科、895屬。其中門水平上豐度排名前十的為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、綠彎菌門和Candidatus Saccharibacteria，占總細(xì)菌豐度的94%以上，而其余32個(gè)門僅占6%左右。屬水平上豐度前十的菌屬包括未分類菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、酸桿菌屬Gp1、產(chǎn)黃桿菌屬、芽單胞菌屬、酸桿菌屬Gp6、放線菌屬、疣微菌屬、副球菌屬和酸桿菌屬Gp3，其中未分類細(xì)菌占絕對優(yōu)勢（12.32%～14.92%）。見表1、2。比較道地和非道地產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌中門水平、屬水平豐度前十的細(xì)菌種類發(fā)現(xiàn)，浙江和陜西元胡的根際細(xì)菌在門水平和屬水平組成種類無差異，但在豐度上有差異（P＜0.05）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，門水平上道地產(chǎn)區(qū)的酸桿菌門和厚壁菌門的細(xì)菌比非道地產(chǎn)區(qū)更高；而變形菌門和擬桿菌門的細(xì)菌則更低。屬水平來看，道地產(chǎn)區(qū)的酸桿菌屬Gp1豐度比非道地產(chǎn)區(qū)更高，而鞘氨醇單胞菌屬、疣微菌某屬則更低。

2.3 不同產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌的功能基因類別分析通過16s測序獲得的物種構(gòu)成推測樣本中功能基因的構(gòu)成，利用COG與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能基因分析。將道地和非道地產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌的Unigenes經(jīng)COG功能分類后，歸類到24個(gè)功能類別中，其中與代謝相關(guān)的基因占37.28%～37.63%，其主要功能包括能源產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換、氨基酸、核苷酸、碳水化合物、輔酶、脂質(zhì)、無機(jī)離子以及次生代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；與細(xì)胞形成和信號相關(guān)的基因占24.52%～25.24%，其主要功能包括細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成、細(xì)胞周期控制、翻譯后修飾、細(xì)胞運(yùn)動及細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)龋慌c信息儲存和處理的基因占17.57%～17.91%，其主要功能包括DNA復(fù)制、重組和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和翻譯、RNA加工修飾等；此外與一般功能預(yù)測和功能未知的基因占19.81%～19.97%。見圖2。24個(gè)功能類別中，未知功能最多，其次是負(fù)責(zé)能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、細(xì)胞壁、膜、器形成以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，而負(fù)責(zé)RNA加工修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞骨架的功能基因較少。

表1 不同產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌門水平豐度前十位（%）Tab.1 The top ten abundance of rhizobacteria in phylum level of different C.yanhusuo producing areas(%)

圖2 基于COG數(shù)據(jù)庫的元胡根際土壤細(xì)菌功能基因熱圖Fig.2 The heatmap of rhizobacteria functional genes of C.yanhusuo based on COG databases

經(jīng)KEGG代謝通路分析，將根際細(xì)菌的功能基因注釋到41個(gè)信號通路中，主要包括代謝信號通路（50.60%～50.89%）、人類疾病相關(guān)信號通路（0.10%）、細(xì)胞過程相關(guān)信號通路（4.10%～4.50%）、生物體系統(tǒng)相關(guān)信號通路（13.83%～13.95%）、遺傳信息處理相關(guān)信號通路（16.37%～16.55%）、環(huán)境信息處理相關(guān)信號通路（12.50%～13.07%）和功能未知通路（13.83%～14.20%）等。

2.4 不同產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌功能基因的豐度差異將功能基因豐度值用熱圖表示。結(jié)果表明，道地和非道地產(chǎn)區(qū)的根際細(xì)菌功能基因類群雖然相同，但不同產(chǎn)區(qū)其功能基因的豐度明顯不同?；赑ICRUSt功能二級分類結(jié)果，比較樣本或組間豐度差異發(fā)現(xiàn)，道地產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌的功能基因主要側(cè)重于糖類運(yùn)輸和代謝，轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞外膜的生物形成以及防御機(jī)制，未知功能也明顯高于非道地產(chǎn)區(qū)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。相比之下，非道地產(chǎn)區(qū)的元胡根際細(xì)菌功能基因主要側(cè)重于RNA加工和修飾，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)，細(xì)胞周期控制，核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，輔酶運(yùn)輸和代謝，脂質(zhì)運(yùn)輸和新陳代謝，翻譯后修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及細(xì)胞骨架等，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 3。

基于KEGG Pathway功能分析比較發(fā)現(xiàn)，道地產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢功能基因包括糖代謝、轉(zhuǎn)錄、多糖生物合成和代謝、酶家族的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解、信號分子和相互作用、內(nèi)分泌系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病，未知功能基因也占一定優(yōu)勢，而非道地產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢功能基因包括感覺系統(tǒng)、細(xì)胞通訊、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、癌癥、細(xì)胞生長和死亡、輔酶和維生素的代謝、外源性物質(zhì)降解和代謝、其他氨基酸的代謝，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.5 不同產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌功能基因的主成分分析及非度量多維尺度法分析 將不同產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌功能基因作基于功能的主成分分析（principal component analysis，PCA）以及非度量多維尺度法（non-metric multidimensional scaling，NMDS） 分析，結(jié)果顯示PCA1的貢獻(xiàn)率為98.66%、PCA2的貢獻(xiàn)率為0.86%。在PCA1、PCA2的貢獻(xiàn)率下，浙江元胡細(xì)菌聚為一類，陜西聚為一類。NMDS圖顯示結(jié)果與PCA一致，同一產(chǎn)區(qū)聚為一類。PCA與NMDS結(jié)果與基于功能基因的聚類分析也一致。見圖4。

3 討論

中藥材元胡存在道地性，藥效成分是道地性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。元胡主要藥效成分為生物堿，比較道地產(chǎn)區(qū)和非道地產(chǎn)區(qū)的元胡有效成分的含量發(fā)現(xiàn)，道地產(chǎn)區(qū)的元胡中生物堿含量明顯高于非道地產(chǎn)區(qū)，其品質(zhì)也更勝一籌[15-16]。除了元胡，三七、獨(dú)活等中藥亦存在道地性，三七主要成分多糖類及皂苷類[17]、獨(dú)活中蛇床子素和二氫歐山芹當(dāng)歸酸酯含量[18]、川芎中藁本內(nèi)酯和阿魏酸含量[19]、姜黃中姜黃素含量[20]都存在產(chǎn)區(qū)差異，充分表明道地藥材的優(yōu)越性。中藥材道地性研究不可忽視其根際微生物的存在。研究表明，根際微生物能夠增強(qiáng)擬南芥磷酸鹽使用率，激活植物營養(yǎng)源應(yīng)激反應(yīng)[21]；根際假單胞菌能夠產(chǎn)生植物生長促進(jìn)的2-3-丁二烯和乙酰丁胺酶，同時(shí)產(chǎn)生氨基環(huán)丙烷羧酸（aminocyclopropane-l-carboxylic acid，ACC）脫氨酶保護(hù)植物免受環(huán)境壓力[22]，表明土壤微生物與藥材生長、品質(zhì)密切相關(guān)。本研究中比較元胡根際細(xì)菌群落發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)區(qū)細(xì)菌的豐度有明顯的差異，道地產(chǎn)區(qū)的酸桿菌門和厚壁菌門比非道地產(chǎn)區(qū)更高，而變形菌門和擬桿菌門則更低。由于細(xì)菌的功能不同，它們聚集在元胡根周圍，與元胡相互作用，勢必會影響元胡的生長，進(jìn)而可能改變元胡的品質(zhì)和藥效。

表2 不同產(chǎn)區(qū)元胡根際細(xì)菌屬水平豐度前十位（%）Tab.2 The top ten abundance of rhizobacteria in genus level of different C.yanhusuo producing areas(%)

圖3 不同產(chǎn)區(qū)元胡根際土壤細(xì)菌功能基因豐度差異Fig.3 The abundance differences of rhizobacteria functional genes of different C.yanhusuo producing areas

圖4 基于COG數(shù)據(jù)庫的元胡根際土壤細(xì)菌功能基因的多維度分析Fig.4 The dimensional analysis The PCA and NMDS of rhizobacteria functional genes of C.yanhusuo based on COG databases

研究發(fā)現(xiàn)，不同功能的微生物聚集會對生物產(chǎn)生一定影響，腸道中多性擬桿菌（BT菌）具有代謝谷氨酸鹽的能力，與肥胖癥發(fā)生相關(guān)[23]；普氏菌和普通擬桿菌是支鏈氨基酸（branched chain aminoacid,BCAAs）的合成菌種，與2型糖尿病相關(guān)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是道地還是非道地產(chǎn)區(qū)，元胡根際土壤細(xì)菌功能基因分類基本相同，主要包括代謝相關(guān)、細(xì)胞形成、信息儲存和處理、細(xì)胞生命活動等相關(guān)基因。這些功能基因不僅能調(diào)控土壤根際細(xì)菌的生命活動，生理代謝，同時(shí)也會影響植物生長發(fā)育。其中代謝相關(guān)功能是元胡根際細(xì)菌的最主要功能基因，所占比例最大，表明微生物代謝可能與元胡道地性密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，土壤微生物代謝過程中能夠產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，如產(chǎn)生嗜鐵素鰲合土壤中有限的三價(jià)鐵離子（Fe3+）[25]；鏈霉菌、芽孢桿菌等生防菌產(chǎn)生抗生素、抑菌蛋白、幾丁質(zhì)酶，葡聚糖酶等抑制病菌與有害物質(zhì)[26]；芽孢桿菌、鏈霉菌和假單胞菌等代謝產(chǎn)生或者誘導(dǎo)植物產(chǎn)生各類激素以促進(jìn)植物生長[27-29]。而生物固氮和溶磷等代謝活動同樣會影響植物生長，提高作物產(chǎn)量[30-31]。

同時(shí)，本研究對比了元胡道地產(chǎn)區(qū)和非道地產(chǎn)區(qū)間的土壤細(xì)菌功能基因組成差異發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)功能基因的豐度均存在產(chǎn)區(qū)差異，而功能基因豐度的產(chǎn)區(qū)差異亦可能是導(dǎo)致元胡道地性的一個(gè)重要原因。浙江組土壤微生物在糖類合成代謝、次生代謝物合成、酶家族合成等功能基因上表現(xiàn)優(yōu)勢。元胡生物堿主要為異喹啉型生物堿，其主要來源于苯丙氨酸和酪氨酸，通過復(fù)雜的環(huán)合反應(yīng)，并在酶的催化下形成。營養(yǎng)物質(zhì)、次生代謝物以及酶合成等優(yōu)勢功能基因很有可能促進(jìn)及影響以氨基酸為原料的元胡生物堿的合成。除此之外，浙江道地產(chǎn)區(qū)功能基因亦表現(xiàn)優(yōu)勢的防御機(jī)制，優(yōu)勢的防御機(jī)制以及次生代謝產(chǎn)物對防治土傳病害以及促進(jìn)植物生長方面亦有深遠(yuǎn)影響。這些道地產(chǎn)區(qū)中優(yōu)勢的功能基因以及一些未知功能的基因很有可能促進(jìn)了元胡道地性的產(chǎn)生。中藥材道地性研究過程中，根際土壤的功能基因組成是一個(gè)全新的領(lǐng)域，值得深入研究討論。

總之，道地產(chǎn)區(qū)和非道地產(chǎn)區(qū)元胡的根際細(xì)菌群落以及細(xì)菌的功能基因豐度均有明顯差異，主要表現(xiàn)在糖代謝、次生代謝物合成、細(xì)胞結(jié)構(gòu)形成以及細(xì)胞通訊等方面，這些功能基因很可能與元胡的道地性形成密切相關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，元胡根際還存在大量的未知細(xì)菌，這些細(xì)菌的作用也不容忽視，它們的存在對元胡的間接影響也值得深究。

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