轉(zhuǎn)基因鯉魚與對照鯉腸道微生物群落差異研究

饒劉瑜　李學(xué)梅　李星浩　朱文根　余育和　顏慶云

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 中國科學(xué)院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京100049; 3. 中國水產(chǎn)學(xué)院長江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223;4. 中山大學(xué), 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣州 510275)

魚類腸道中寄居著復(fù)雜多樣的微生物菌群, 它們共同構(gòu)成了一個重要的功能單元, 也被稱為宿主特定的“器官”, 并與宿主相互依存、互利共生[1,2]。魚類腸道中微生物菌群的形成過程十分復(fù)雜, 且在不同的生長發(fā)育階段, 微生物組成和數(shù)量也有規(guī)律地進行演替, 也會因魚類所生活的水環(huán)境以及攝食條件等不同而有所差異[3,4]。水體中殘留的農(nóng)藥、抗生素, 以及養(yǎng)殖過程微生物制劑的使用等也可對魚類腸道中的微生物菌群結(jié)構(gòu)造成一定的影響[5,6]。此外, 由于種類、年齡、基因等因素的影響, 不同的魚類腸道微生物組成也不同。目前已經(jīng)證實, 宿主基因型是影響高等哺乳動物腸道微生物群落組成的重要因素之一[7,8], 而對于低等脊椎動物的研究較少。Ley等[9]通過研究小鼠發(fā)現(xiàn), 親子代之間、子代個體之間的盲腸微生物菌群組成結(jié)構(gòu)相似, 而無血緣關(guān)系的小鼠在屬水平上存在明顯不同。Zoetendal等[10]通過比較不同人群糞便中微生物群落16S rRNA基因序列發(fā)現(xiàn), 雙胞胎腸道微生物的相似性遠(yuǎn)高于夫妻之間或完全不相關(guān)的2個個體。本研究以轉(zhuǎn)“全魚”生長激素基因鯉為研究對象, 采用454高通量測序?qū)?6S rRNA基因測序的方法分析其腸道微生物組成, 旨在探討轉(zhuǎn)“全魚”生長激素基因鯉與對照鯉腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的組成差異, 為進一步研究轉(zhuǎn)基因魚生長代謝和抗病能力與腸道微生物之間的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　樣品采集

實驗所用轉(zhuǎn)“全魚”生長激素基因鯉和對照鯉養(yǎng)殖于中國科學(xué)院水生生物研究所魚類基因工程學(xué)學(xué)科組官橋養(yǎng)殖基地。孵化3d后開始部分進食,但在一定程度上還依賴于自身的營養(yǎng); 孵化6d后,卵黃囊消失并開始平游, 此時營養(yǎng)獲取主要依賴于水體中的浮游生物。本研究從第6天開始腸道樣品采集, 在所有樣品采集前, 對其進行饑餓24h處理。由于此時的魚個體小, 為確保腸道樣品微生物的總DNA量, 將5條仔魚的腸道混合在一起作為1個樣品。之后分別采集2月齡(2 m)和5月齡(5 m)的幼魚通過氧氣袋打包帶回實驗室, 用于采集腸道內(nèi)容物(1條幼魚的腸道作為一個樣品), 最后得到轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉各3個樣品。實驗期間, 轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉飼養(yǎng)于同一水源環(huán)境中, 投喂相同的人工飼料。試驗期間水溫23—30℃, 分別在每天9：00和15：00投喂。

1.2　腸道微生物群落總DNA提取

參照已有方法[11]收集腸道和腸道內(nèi)容物。向每管樣品加入1 mL裂解液, 再采用常規(guī)的酚/氯仿/異戊醇法進行抽提純化總DNA。

1.3　PCR擴增及測序分析

將純化后的基因組DNA作為PCR模板, 對微生物基因組16S rRNA V1-V3區(qū)進行擴增, 其序列分別為27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和533R (5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′), 同時在正向引物5' 端添加Barcode序列區(qū)分樣品[12]。反應(yīng)體系含： 5×FastPfu緩沖液 4.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2μL、正向引物(5 μmol/L) 0.4μL、反向引物(5 μmol/L) 0.4μL、FastPfu聚合酶 0.4μL、模板DNA 10 ng, 補ddH2O至 20μL。PCR反應(yīng)是在S1000TM熱循環(huán)儀上(Bio-Rad, 美國)進行, 反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性 2min, 95℃變性30s, 55℃退火30s,72℃延伸30s, 25個循環(huán)后, 72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用1.5%的5μL瓊脂糖凝膠100V穩(wěn)壓電泳以檢測PCR擴增效果, 擴增后得到的產(chǎn)物用QIAquick凝膠回收試劑盒(Qiagen, 美國)純化回收, 然后每個樣品取200 ng等量混合后在美吉生物有限公司(上海)GS FLX (454 Life Sciences/Roche Applied Science)高通量測序平臺進行測序[13,14]。

1.4　數(shù)據(jù)分析

在454測序完成后, 使用Mothur (www.mothur.org)生物信息學(xué)軟件包在97%序列相似性下, 以最遠(yuǎn)鄰近算法對454測序序列進行聚類劃分分類單元(Operational taxonomic unit, OTU), 應(yīng)用Ribosomal Database Project (RDP, http：//rdp.cme.msu.edu/)在線分析工具對454測序數(shù)據(jù)進行微生物種類劃分。通過SPSS軟件對比實驗組和對照組的Alpha-多樣性,用EXCEL 2010軟件對OTU種類的豐度進行分析,篩選出相對豐度大于0.1%的OTU的優(yōu)勢菌, DCA分析則用來比較不同發(fā)育時期兩種魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。

2　結(jié)果

2.1　轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉腸道微生物差異性比較

對轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉進行除趨勢對應(yīng)分析(Detrended correspondence analysis, DCA)并構(gòu)建圖(圖 1)。從圖中可以看出, 6日齡及5月齡的樣點靠的比較近, 說明在兩組樣品的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異相對較小。而2月齡的轉(zhuǎn)基因鯉與對照鯉的點相距很遠(yuǎn), 表明在2月齡的轉(zhuǎn)基因鯉與對照鯉腸道菌群存在一定差異。

進一步比較轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉的腸道微生物的α-多樣性, 并構(gòu)建箱線圖(圖 2)。 從圖中可以看出, 處理組樣品的Shannon多樣性指數(shù)、pielou.evenness指數(shù)和inverse.Simpson指數(shù)、Shannon.evenness指數(shù)均大于對照組, 表明轉(zhuǎn)基因鯉的腸道微生物α-多樣性要比對照組鯉高。

2.2　轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉腸道微生物組成

將454測序獲得的序列經(jīng)RDP數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn), 6個腸道樣本內(nèi)微生物OTUs分屬17個門, 包括放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)等。總體來看, 相比對照鯉, 轉(zhuǎn)基因鯉腸道內(nèi)梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)的豐度增加, 而變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度減少。

圖 1　轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉腸道微生物差異性分析Fig. 1　Difference analysis of gastrointestinal microbiota in transgenic common carp and controls

圖 2　轉(zhuǎn)基因鯉與對照鯉腸道微生物α-多樣性比較Fig. 2　Alpha-diversity of gastrointestinal microbiota in transgenic common carp and controls

變形菌門在轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉腸道樣品中均為優(yōu)勢菌門, 變形菌門在轉(zhuǎn)基因鯉腸道菌群中所占比例32.46%—53.85%; 其次為梭桿菌門和放線菌門, 分別占轉(zhuǎn)基因鯉腸道總細(xì)菌的7.78%—28.36%和13.93%—22.14%; 另外, 擬桿菌門占的比例為5.6%—17.91%, 厚壁菌門占2.72%—14.93%。變形菌門在對照鯉腸道菌群中所占比例為29.98%—53.98%; 而梭桿菌門、放線菌門和厚壁菌門, 分別占對照鯉腸道總細(xì)菌的1.99%—21.27%、16.67%—26.87%和1.37%—11.82%; 另外, 擬桿菌門所占的比例為12.31%—13.56%, 其他的不常見細(xì)菌門所占比例相對較少。

厚壁菌門(Firmicutes)主要存在于轉(zhuǎn)基因鯉腸道中, 而對照鯉中擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度較高。且隨著鯉腸道的發(fā)育, 轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉腸道內(nèi)變形菌門的豐度呈現(xiàn)下降趨勢。針對不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉進行分析, 2種魚在6日齡時, 主要優(yōu)勢菌門(Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Fusobacteria)在兩種魚腸道菌群中所占比例相似, 但隨著發(fā)育, 在2月齡和5月齡時表現(xiàn)出差異(圖 3), 且2月齡時兩者差異更為明顯。

有研究表明擬桿菌門和厚壁菌門的比例在人類當(dāng)中一直被認(rèn)為與宿主的肥胖存在密切關(guān)系[18]。對不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉腸道內(nèi)這兩種菌的比值進行比較, 結(jié)果顯示兩種魚之間不存在顯著差異性(One-way ANOVA： F=0.554, P＞0.05)。但從表 1可以觀察到, 轉(zhuǎn)基因鯉各發(fā)育階段, 除6日齡外, 2月齡和5月齡中厚壁菌門所占比例均大于擬桿菌門; 而對照鯉在3個發(fā)育階段中厚壁菌門比例均低于擬桿菌門, 特別對比在2月齡時腸道微生物Bacteroidetes/Firmicutes的比例, 轉(zhuǎn)基因鯉(0.392)明顯小于對照鯉(8.978)。

圖 3　轉(zhuǎn)基因鯉(T)和對照鯉(C)腸道菌群的主要門Fig. 3　Major bacterial phylum in the intestine of transgenic common carp (T) and controls (C)

進一步在屬水平的分析發(fā)現(xiàn), 6日齡鯉腸道內(nèi),轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉內(nèi)存在共有優(yōu)勢菌(相對豐度大于0.1%)16種, 轉(zhuǎn)基因鯉存在6種特有優(yōu)勢菌, 而對照鯉存在2種特有優(yōu)勢菌; 2月齡鯉腸道內(nèi), 存在共有7種優(yōu)勢菌, 轉(zhuǎn)基因鯉10種特有優(yōu)勢菌, 對照鯉11種特有優(yōu)勢菌; 5月齡鯉腸道內(nèi), 存在共有14種優(yōu)勢菌, 轉(zhuǎn)基因鯉4種特有優(yōu)勢菌, 對照鯉6種特有優(yōu)勢菌。其中2月齡轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉腸道微生物的共有優(yōu)勢菌種類最少, 而特有優(yōu)勢菌種類最多, 說明在3個發(fā)育時期中, 2月齡轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉腸道微生物組成結(jié)構(gòu)差異最大。

表 1　擬桿菌門和厚壁菌門細(xì)菌在轉(zhuǎn)基因鯉(T)和對照鯉(C)腸道中相對豐度比較Tab. 1　The relative ambulance of Bacteroidetes and Firmicutes between transgenic common carp (T) and controls (C)

分別對轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉在3個發(fā)育階段各自特有的優(yōu)勢菌屬(豐度大于0.1%)進行分析發(fā)現(xiàn), 6日齡轉(zhuǎn)基因鯉有18種特有優(yōu)勢菌, 而同期的對照鯉只有9種; 2月齡轉(zhuǎn)基因鯉19種, 對照鯉33種; 5月齡轉(zhuǎn)基因鯉5種, 對照鯉只有1種特有優(yōu)勢菌(圖 4)。

同時還發(fā)現(xiàn)在發(fā)育過程中, 在2月齡時, 兩種魚的微生物類群特有OTU數(shù)最多, 而共有OTU數(shù)最少, 且轉(zhuǎn)基因鯉腸道微生物OTU數(shù)(108)大于對照鯉(93), 而在6日齡和5月齡中兩者數(shù)值相似, 說明2月齡兩種魚腸道微生物種類存在差異(圖 5)。

3　討論

魚類腸道微生物可分泌多種消化酶(如蛋白酶、纖維素酶等)以參與宿主營養(yǎng)物質(zhì)代謝, 微生物還能調(diào)節(jié)魚類機體免疫, 因此對促進魚類生長發(fā)育、維持宿主健康等均具有非常重要的作用[19—21]。已有研究表明, 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)主要由宿主自身(如遺傳背景、發(fā)育階段、健康狀況、飲食條件等)及外界環(huán)境因素等所決定[22,23]。不同物種之間腸道微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同, 但在同一物種的特定發(fā)育階段能保持相對穩(wěn)定[24—26]。Stevens和Devlin[27]指出, 食欲過剩以及生長激素基因可直接或間接引起腸道幾乎所有形態(tài)的改變, 其中生長激素基因?qū)δc道組織產(chǎn)生了直接影響, 主要是使魚類發(fā)生短期腸道形態(tài)學(xué)的變化, 以應(yīng)對短期需求的變化。

3.1　腸道微生物群落組成分析

本研究旨在探討同一生長環(huán)境下, 轉(zhuǎn)入外源生長激素基因的轉(zhuǎn)基因鯉腸道微生物群落與對照鯉腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)差異。與哺乳動物相似, 水生動物的遺傳背景與環(huán)境條件、食性差異、發(fā)育階段等都是影響腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素。本研究通過對6日齡、2月齡和5月齡轉(zhuǎn)“全魚”生長激素基因鯉(Cyprinus carpio L.)與對照鯉腸道菌群的分析, 發(fā)現(xiàn)2月齡魚腸道微生物組成在轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉之間存在差異, 而其他兩個時期間的差異不明顯。主要可能是在2月齡魚腸道的分化可能使其產(chǎn)生了發(fā)育差異, 因為在該時期轉(zhuǎn)基因鯉表現(xiàn)出比對照鯉明顯快的生長速度, 各自形成了不同的內(nèi)環(huán)境, 從而形成了不同的消化道微生物群落[11]。

圖 4　轉(zhuǎn)基因鯉(T)和對照鯉(C)腸道優(yōu)勢菌屬(＞ 0.1%)Fig. 4　Dominant bacterial genus (＞ 0.1%) of the intestinal microbes in transgenic common carp (T) and controls (C)

圖 5　轉(zhuǎn)基因鯉(T)和對照鯉(C)腸道微生物OTU數(shù)維恩圖Fig. 5　Venn diagram showing the common and specific OTUs in transgenic common carp (T) and controls (C)

3.2　腸道微生物門水平和屬水平差異

對各發(fā)育時期腸道微生物在門水平上的豐度進行分析發(fā)現(xiàn), 在6日齡時兩種魚腸道內(nèi)主要優(yōu)勢菌群中所占比例相似, 而2月和5月齡差異較大?？赡苁且驗檗D(zhuǎn)基因鯉和對照鯉在6日齡時剛剛開口不久, 卵黃囊未完全吸收, 且又處于同一環(huán)境, 此時腸道微生物群落結(jié)構(gòu)剛剛開始形成, 故它們的腸道優(yōu)勢微生物種類和豐度均相似。而隨著卵黃囊被吸收完, 轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉開始完全依賴于外源性食物, 2月齡和5月齡時腸道微生物組成差異顯著, 說明隨著2種魚腸道發(fā)育可能分別建立了不同的腸道微生物群落。

近年來腸道微生物和肥胖的關(guān)系受到了廣泛關(guān)注, 研究發(fā)現(xiàn)肥胖主要與人類腸道中擬桿菌門和厚壁菌門微生物的豐度變化有關(guān)[28], 但在魚類腸道微生物研究中是否也存在, 有待進一步研究。Turnbaugh等[29]研究發(fā)現(xiàn), 與正常個體比較, 肥胖個體腸道微生物中Firmicutes比例較高, 而Bacteroidetes比例較低; 當(dāng)肥胖個體減肥成功時, 其腸道微生物中Firmicutes比例則與正常個體變得較為相似。通過進一步比較, 隨著鯉的發(fā)育, 轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉腸道內(nèi)比例最高的優(yōu)勢菌門Proteobacteria豐度均呈現(xiàn)明顯下降趨勢, 且厚壁菌門主要存在于轉(zhuǎn)基因鯉腸道中, 而對照鯉中擬桿菌門較多, 說明了轉(zhuǎn)生長激素基因的表達(dá), 可能引起了轉(zhuǎn)基因鯉腸道內(nèi)微生物群落的改變, 導(dǎo)致了厚壁菌增多, 而擬桿菌減少。在2月齡時轉(zhuǎn)基因鯉腸道微生物中的Bacteroidetes/ Firmicutes比例明顯小于對照鯉, 從而促進了轉(zhuǎn)基因鯉的快速生長, 這與Li等[11]基于熒光定量PCR的結(jié)果是吻合的。

相對兩種魚在6日齡和5月齡的腸道微生物對比分析, 在屬水平2月齡轉(zhuǎn)基因鯉和對照鯉腸道微生物共有優(yōu)勢菌種類最少, 而特有優(yōu)勢菌種類最多,而且在該發(fā)育時期轉(zhuǎn)基因鯉各菌群的豐度均發(fā)生了變化。

3.3　展望

有研究發(fā)現(xiàn)小鼠高密度脂蛋白基因的突變也會引起其腸道微生物群落組成的改變, 但宿主基因?qū)ξ⑸锏挠绊懖⒎侵苯? 而是間接通過機體新陳代謝起作用[30,31]。范新浩等[32]利用高通量測序技術(shù)比較了3月齡轉(zhuǎn)入內(nèi)源性lncRNA-GTL2 的轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠的腸道微生物, 結(jié)果顯示小鼠腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)和構(gòu)成總體上雖沒有顯著差異, 但存在一定的個體差異。

基于轉(zhuǎn)基因鯉機體軀干和背部肌肉發(fā)達(dá), 生長速度快, 體長、全長顯著大于對照鯉等特征[33], 可以推斷宿主基因型變化可能影響了宿主魚類的物質(zhì)代謝進而導(dǎo)致其表型的改變。本研究結(jié)果表明,2月齡轉(zhuǎn)基因鯉的腸道微生物組成與對照鯉相比發(fā)生了改變, 而這些改變是否因轉(zhuǎn)“全魚”生長激素基因引起尚有待研究。下一步可針對2月齡轉(zhuǎn)基因鯉各方面的生理特征以及宿主代謝機制進行研究, 確定外源激素表達(dá)與腸道微生物結(jié)構(gòu)、食物轉(zhuǎn)化率、生長速率等之間的關(guān)系, 為進一步揭示轉(zhuǎn)基因鯉快速生長效應(yīng)的微生物學(xué)調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

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