三疣梭子蟹PtToll-1受體的原核表達(dá)及組織、細(xì)胞分布研究

張丹楓　王國良　楊　寧,　張　鑫　周素明　劉　順

(1. 寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211; 2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 青島 266109)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隸屬甲殼綱(Crustacea), 十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae), 梭子蟹屬(Portunus), 俗稱白蟹、槍蟹等,廣泛分布于中國、朝鮮、日本及馬來西亞群島等海域, 在我國是一種主要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類[1]。因其養(yǎng)殖產(chǎn)量較高, 肉質(zhì)鮮美, 營養(yǎng)豐富, 經(jīng)濟(jì)效益高,現(xiàn)已成為我國東部沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖品種。近年來, 隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高, 其病害日趨嚴(yán)重, 特別是由細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等引起的疾病頻頻暴發(fā), 嚴(yán)重影響三疣梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展[2—5]。三疣梭子蟹是低等的海洋無脊椎動(dòng)物, 缺乏后天免疫系統(tǒng), 主要依賴其先天性免疫系統(tǒng)來抵御病原微生物的入侵[6]。深入研究三疣梭子蟹的先天性免疫防御機(jī)制, 并探討提高三疣梭子蟹抗病力的有效途徑和方法, 有助于保持三疣梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[7]。

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是一類介導(dǎo)識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMP)的膜受體[8], 在機(jī)體抗感染等天然免疫過程中發(fā)揮重要作用[9]。20世紀(jì)90年代, 研究者首次在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中發(fā)現(xiàn)Toll受體的存在[10,11], 隨后在人、小鼠、哺乳動(dòng)物、魚類、軟體動(dòng)物及其他節(jié)肢動(dòng)物等中也發(fā)現(xiàn)大量的Toll樣受體[12]。目前在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)存在9種不同類型的Toll受體1—9, 然而其中只有Toll-1介導(dǎo)經(jīng)典的Toll-MyD88信號通路, 也稱之為抗菌肽通路[13,14]。在甲殼動(dòng)物中, 國內(nèi)外學(xué)者相繼從中國明對蝦[15](Fenneropenaeus chinensis)、凡納濱對蝦[16—18](Litopenaeus vannamei)、日本對蝦[19](Penaeus japonicus)、擬穴青蟹[20](Scylla Paramamosain)和中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)中克隆出Toll受體相關(guān)分子[21]。本實(shí)驗(yàn)室從三疣梭子蟹中已經(jīng)克隆出3種不同Toll受體分子PtToll1-3[22], 生物信息學(xué)及蛋白同源性比對發(fā)現(xiàn)只有PtToll-1同果蠅的Toll-1無論在蛋白結(jié)構(gòu)還是在進(jìn)化關(guān)系上均比較接近, 由此推測三疣梭子蟹的PtToll-1受體可能對三疣梭子蟹的抗菌肽的表達(dá)具有調(diào)控作用, 因此對PtToll-1展開相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究基礎(chǔ)之上, 對三疣梭子蟹Toll-1受體進(jìn)行原核表達(dá)、蛋白純化及制備相應(yīng)的抗血清, 還利用組織免疫熒光技術(shù)首次在蛋白水平上研究PtToll-1在消化道、肝胰腺、鰓、心臟及肌肉組織中的分布, 并且通過細(xì)胞免疫組化和免疫熒光首次在血細(xì)胞中進(jìn)行PtToll-1的分布定位,同時(shí)進(jìn)行體外真核表達(dá)在HEK-293T細(xì)胞中的定位,以期為深入探討三疣梭子蟹PtToll-1受體蛋白的生理及免疫學(xué)功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用三疣梭子蟹(大約150 g)購于寧波市路林市場, 健康活力好。實(shí)驗(yàn)用小鼠購置浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)用HEK-293T細(xì)胞株、大腸桿菌菌株以及原核表達(dá)載體、實(shí)驗(yàn)試劑均購置寧波航景生物公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

三疣梭子蟹Toll-1受體胞外結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)載體的構(gòu)建對三疣梭子蟹Toll-1受體的全基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 并且對PtToll-1蛋白的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測?；诜治鲱A(yù)測結(jié)果, 應(yīng)用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物, 用于PtToll-1受體胞外結(jié)構(gòu)域片段的亞克隆。該區(qū)域不包括信號肽部分、跨膜區(qū)以及細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)區(qū)。亞克隆引物以及測序引物詳見表1。引物由生工生物工程有限公司(上海)合成。

取健康三疣梭子蟹的血細(xì)胞, 提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA, 以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)來擴(kuò)增PtToll-1受體胞外結(jié)構(gòu)域。反應(yīng)體系為50 μL,PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s, 55℃退火15s, 72℃延伸30s, 反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化及加A尾后直接連接至pEASY?-E1 Expression Vector上。將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中, 用T7 Promoter Primer和PtToll-1-R擴(kuò)增并測序鑒定陽性克隆為pEASY-E1-PtToll-1。

PtToll-1胞外結(jié)構(gòu)域的誘導(dǎo)表達(dá)將轉(zhuǎn)入pEASY-E1-PtToll-1的菌液接種于含有氨芐LB液體培養(yǎng)基中, 用終濃度為0.3 mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)1h、3h及5h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后, 離心收集菌體并加入PBS重懸, 超聲破碎細(xì)胞。離心后上清與沉淀分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳, 檢測目的蛋白的表達(dá)情況。

抗PtToll-1多克隆抗體制備將乳化好的蛋白抗原對小鼠進(jìn)行免疫, 首次免疫劑量為100 μg/只,次免2次, 每次劑量為50 μg/只, 免疫間隔時(shí)間為7d。最后一次免疫后5d摘除免疫小鼠眼球進(jìn)行取血, 血液置于4℃冰箱過夜, 2000×g, 4℃離心10min分離血清, 免疫血清分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Western Blot將SDS-PAGE后的蛋白膠電轉(zhuǎn)至NC膜上, 用5%的脫脂奶粉室溫孵育封閉1h,TBST漂洗印跡膜1遍。加入多克隆抗體一抗(1∶1000), 室溫孵育1h, 后室溫下漂洗3次。加入稀釋好的商品化二抗(1∶2000), 室溫下孵育1h后室溫下漂洗3次。將漂洗好的印跡膜浸入到BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色液中, 室溫避光孵育10min。同時(shí)做非免疫血清陰性對照。顯色完畢將膜浸入水中, 終止反應(yīng)。Bio-Rad凝膠成像儀拍照。

免疫組化取適量血淋巴細(xì)胞均勻涂在多聚賴氨酸處理過的載玻片上, 自然干燥固定, 用3%H2O2室溫處理5—10min以滅活內(nèi)源性酶, 蒸餾水洗3次。滴加正常山羊血清封閉液室溫封閉20min后滴加適當(dāng)稀釋的一抗(1∶100), 37℃孵育1h, PBS洗3次后滴加生物素化的兔抗小鼠IgG, 37℃孵育20min, 漂洗3次后滴加試劑SABC-AP, 37℃孵育20min, 漂洗3次; 將BCIP/NBT顯色試劑混勻后加至玻片, 37℃顯色10—30min, 水洗后核固紅輕度復(fù)染, 水洗, 干燥后水溶性封片劑封片, 顯微鏡下觀察拍照。陰性對照一抗為非免疫小鼠血清。

表1　胞外區(qū)擴(kuò)增引物及通用引物序列Tab. 1　Primers for amplification and sequencing

間接免疫熒光組織免疫熒光： 分別取三疣梭子蟹的消化道、肝胰腺、鰓、心臟和肌肉組織,4%多聚甲醛固定24h, 梯度乙醇脫水, 二甲苯透明,石蠟包埋、切片。將白片放入烘干后經(jīng)過二甲苯脫蠟, 乙醇復(fù)水, 檸檬酸抗原修復(fù)后, 用5% BSA室溫封閉30min,, 滴加適量一抗4℃孵育過夜, PBS洗滌3次; 加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG, 37℃孵育30min, PBS洗滌3次, 抗熒光淬滅封存液封片, 熒光顯微鏡下觀察拍照。陰性對照一抗為非免疫小鼠血清。

細(xì)胞免疫熒光： 將血淋巴細(xì)胞涂于載玻片上,晾干后用4%多聚甲醛固定30min, 3% H2O2室溫處理10min, 5% BSA室溫封閉30min, 甩去封閉液, 滴加適量一抗37℃孵育1h, PBS洗3次/10min; 滴加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG, 37℃孵育30min, PBS洗3次后滴加抗熒光淬滅封存液封片后于熒光顯微鏡下觀察拍照。陰性對照一抗為非免疫小鼠血清。

真核表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)用Primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)攜帶有雙酶切位點(diǎn)(5′ Xho I以及3′ Kpn I)的引物, 引物序列見表1。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板來擴(kuò)增具有雙酶切位點(diǎn)的PtToll-1受體胞外結(jié)構(gòu)域。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL, PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s, 55℃退火15s, 72℃延伸30s, 反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化以及加A尾反應(yīng)后連接至pMD-18T載體。將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 用引物M13F和PtToll-1-RM鑒定陽性克隆。陽性克隆菌液經(jīng)過測序無誤后抽提質(zhì)粒。對上述質(zhì)粒以及商品化載體pEGFP-N2(Invitrogen)同時(shí)進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物割膠純化后用T4連接酶于16℃過夜連接。將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞中, 卡那霉素篩選, 經(jīng)過PCR驗(yàn)證正確后抽提質(zhì)粒pEGFP-N2-PtToll-1。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染及觀察HEK293T細(xì)胞鋪在φ14mm細(xì)胞爬片中培養(yǎng)24h后利用商品化脂質(zhì)體Lip2000將構(gòu)建好的pEGFP-N2-PtToll-1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi), 同時(shí)空載體pEGFP-N2同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。細(xì)胞轉(zhuǎn)染12—18h后, 加500 μL免疫染色固定液(Beyotime)固定細(xì)胞10min, 然后每孔加500 μL含有0.1% TritonX-100 PBS緩沖液透膜10min, 經(jīng)過PBS洗滌后加500 μL DAPI染核3—5min, 1% BSA的PBS溶液洗滌3次, 吸盡液體, 往載玻片上滴加1滴抗熒光淬滅封片液, 取出細(xì)胞爬片, 經(jīng)雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞定位并拍照。

2　結(jié)果

2.1　rPtToll-1蛋白的表達(dá)及抗血清特異性檢測

構(gòu)建正確的載體pEASY-E1-PtToll-1菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間后的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 結(jié)果表明： 標(biāo)簽?zāi)康牡鞍字饕园w蛋白的形式存在于沉淀中, 而上清中不含有標(biāo)簽?zāi)康牡鞍? 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)5h后表達(dá)量最高, 且該蛋白分子量約為87.18 kD (圖1a)。

將免疫小鼠獲得的抗血清, 經(jīng)Western Blot檢測, 結(jié)果如圖1b所示, 與對照組非免疫血清(圖1c)比較, 在70—100 kD可見單一條帶, 說明免疫小鼠獲得的抗血清與目的蛋白之間特異性識別, 且制備的抗血清質(zhì)量較高。

2.2　PtToll-1在三疣梭子蟹不同組織中的分布

免疫熒光染色結(jié)果顯示, 在三疣梭子蟹消化道、肝胰腺、鰓、心臟、肌肉組織中均觀察到綠色熒光, 即Toll-1受體在各組織中均有分布。但不同組織中Toll-1受體的分布不同, 具體如下：

三疣梭子蟹消化道免疫熒光染色結(jié)果顯示陽性信號較強(qiáng), 且主要位于消化道黏膜上皮基底部(圖2A)。肝胰腺由肝小管組成, 肝小管由基膜及單層柱狀細(xì)胞構(gòu)成。熒光染色結(jié)果顯示, 陽性信號很弱, 主要位于肝小管上皮(圖2C)。鰓葉由鰓絲和鰓小片構(gòu)成, 免疫熒光結(jié)果顯示, 鰓絲上皮細(xì)胞和其間結(jié)締組織及鰓小片上皮均有較強(qiáng)的陽性信號(圖2E)。心臟有外層結(jié)締組織和內(nèi)層肌肉層組成, 免疫熒光結(jié)果顯示, 內(nèi)層肌肉層具有弱的陽性信號,而外層結(jié)締組織層未見陽性信號(圖2G)。步足肌為橫紋肌, 免疫熒光結(jié)果顯示, 肌纖維陽性信號較弱, 且僅分布在肌膜上(圖2I)。

2.3　PtToll-1在三疣梭子蟹血細(xì)胞中的分布及定位

三疣梭子蟹血細(xì)胞免疫組化結(jié)果如圖3所示,與對照血清處理細(xì)胞相比, PtToll-1抗血清處理過的細(xì)胞表面具有較強(qiáng)陽性信號, 該結(jié)果說明PtToll-1在血細(xì)胞表面表達(dá), 進(jìn)一步從蛋白水平證實(shí)了PtToll-1在三疣梭子蟹血細(xì)胞的分布。另外, PtToll-1在顆粒細(xì)胞中表達(dá)較為強(qiáng)烈, 而在透明細(xì)胞中表達(dá)相對較弱, 該結(jié)果顯示PtToll-1在不同血細(xì)胞中的分布是不均勻的, 這極有可能與不同類型血細(xì)胞的功能不同相關(guān)。

三疣梭子蟹血細(xì)胞主要由透明細(xì)胞和顆粒細(xì)胞組成, 免疫熒光結(jié)果顯示, 各種類型的血細(xì)胞中均有陽性信號, 而細(xì)胞核中未見陽性反應(yīng)。即Toll-1受體主要位于細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中(圖4)。

圖1　PtToll-1胞外結(jié)構(gòu)域重組蛋白SDS-PAGE分析及蛋白免疫印跡檢測結(jié)果Fig. 1　SDS-PAGE analysis of PtToll-1 Protein and the result of Western Blotting

圖2　PtToll-1在消化道、肝胰腺、鰓、心臟及肌肉組織中的分布Fig. 2　The distribution of PtToll-1 in the digestive tract,hepatopancreas, gill, heart and muscle

圖3　PtToll-1三疣梭子蟹血細(xì)胞免疫組化結(jié)果(標(biāo)尺, 25 μm)Fig. 3　PtToll-1 expression in the hemocytes of the crab examined by immunohistochemistry (Scale bar, 25 μm)

2.4　PtToll-1在HEK-293T細(xì)胞中的定位

成功構(gòu)建的PtToll-1真核表達(dá)載體, 經(jīng)過轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞并成功表達(dá)(圖5)。PtToll-GFP融合蛋白主要分布在HEK-293T膜上, 但細(xì)胞質(zhì)中也有少量分布; 而pEGFP-N2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可見綠色熒光信號在細(xì)胞中均分布且沒有表達(dá)特異性(圖5)。

3　討論

三疣梭子蟹Toll受體與其他動(dòng)物TLRs一致同屬于Ⅰ型跨膜蛋白, 由于其蛋白序列較長, 其完整蛋白結(jié)構(gòu)因具有跨膜區(qū)而具有一定的疏水性, 所以難以進(jìn)行完整蛋白的原核表達(dá)。因此, 作者選擇PtToll-1蛋白的胞外區(qū)進(jìn)行體外原核重組表達(dá)及后續(xù)研究。本研究構(gòu)建PtToll-1蛋白胞外結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)載體, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功在大腸桿菌中高效表達(dá)出目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示rPtToll-1蛋白的分子量為87.18 kD, 與預(yù)期蛋白分子量一致。另外,結(jié)果還顯示rPtToll-1蛋白以包涵體的形式存在于大腸桿菌菌體的不可溶成分中。蛋白經(jīng)過尿素溶解、鎳柱純化及脫鹽處理后與弗氏佐劑充分乳化后免疫小鼠獲得特異性抗rPtToll-1蛋白的抗血清,為進(jìn)一步開展PtToll-1蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。

圖4　PtToll-1在血淋巴細(xì)胞中的分布(標(biāo)尺, 25 μm)Fig. 4　The distribution of PtToll-1 in haemocytes (Scale bar, 25 μm)

圖5　PtToll-1在HEK-293T細(xì)胞株中的定位(標(biāo)尺, 20 μm)Fig. 5　Subcellular localizations of PtToll-1 in HEK-293T cells (Scale bar, 20 μm)

Toll樣受體家族在分子結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性, 通常包含有一個(gè)負(fù)責(zé)識別配體的串聯(lián)富含亮氨酸結(jié)構(gòu)基序的胞外區(qū), 一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)以及一個(gè)比較保守的負(fù)責(zé)募集下游信號分子蛋白TIR結(jié)構(gòu)域[23]。根據(jù)TLRs在不同細(xì)胞中表達(dá)特性則可將其分為3類包括廣泛性表達(dá)： 如TLR1廣泛存在于各類血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞及其胞器等; 局限性表達(dá)： 如TLR2和TLR5主要定位于髓源性細(xì)胞膜表面;特異性表達(dá)： 如TLR3主要定位于樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞[24—26]。然而目前有關(guān)低等無脊椎包括甲殼類動(dòng)物組織分布情況僅停留在mRNA水平上,在蛋白水平的研究極少。前期利用實(shí)時(shí)熒光定量方法在mRNA水平上研究了PtToll-1在不同組織的分布情況, 結(jié)果表明, PtToll-1在血淋巴細(xì)胞及鰓中表達(dá)量最高, 而在肌肉中表達(dá)量最低[22]。本研究利用組織免疫熒光技術(shù)在蛋白水平上對PtToll-1在不同組織的分布進(jìn)行研究, 結(jié)果表明, PtToll-1在不同組織中均有分布, 但在不同組織中的分布情況不同。PtToll-1蛋白在鰓中分布最多, 其主要分布在鰓絲上皮細(xì)胞和其間結(jié)締組織及鰓小片上皮; 其次在消化道膜上皮基底部, 而在肝胰腺和步足肌中分布相對較少。該結(jié)果與mRNA水平研究結(jié)果基本保持一致。

血淋巴細(xì)胞是甲殼動(dòng)物重要的免疫細(xì)胞, PtToll-1在血淋巴細(xì)胞的高水平表達(dá)提示了其極有可能參與梭子蟹的先天性免疫過程。哺乳動(dòng)物的研究表明TLRs家族各成員在細(xì)胞中位置不同其功能也不同： 定位于細(xì)胞膜上TLRs如Toll1、Toll2、Toll4、Toll5及Toll6主要參與識別細(xì)菌的脂多糖、脂蛋白及鞭毛等病原相關(guān)模式分子; 分布于各細(xì)胞器膜TLRs如Toll3、Toll7、Toll8及Toll9主要識別侵入細(xì)胞內(nèi)的病毒及細(xì)菌的核酸[27]。本研究以三疣梭子蟹的血淋巴細(xì)胞作為研究模型, 利用免疫熒光及免疫組化技術(shù)對PtToll-1在血淋巴細(xì)胞中的定位進(jìn)行探討。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 2種方法均在血淋巴的細(xì)胞膜上檢測到PtToll-1的表達(dá)。除此之外, 作者還構(gòu)建了三疣梭子蟹Toll-1受體胞外結(jié)構(gòu)域蛋白的真核表達(dá)載體pEGFP-N2-PtToll-1。通過激光共聚焦顯微技術(shù)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-PtToll-1重組質(zhì)粒的細(xì)胞其細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上具有綠色熒光信號, 而對照空質(zhì)粒則在整個(gè)細(xì)胞均有綠色熒光, 該結(jié)果說明pEGFP-PtToll-1蛋白在HEK293細(xì)胞膜上是表達(dá)的。該結(jié)果也驗(yàn)證了PtToll-1在血淋巴細(xì)胞定位的結(jié)果。

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