泛素連接酶TRIM在固有免疫信號通路中的研究進展

張洪海， 張 磊

(山東大學 基礎醫(yī)學院， 濟南 250012 )

蛋白泛素化是指泛素分子在一系列酶包括El泛素激活酶，E2泛素結合酶以及E3泛素連接酶作用下，對靶蛋白進行特異性修飾的過程。研究表明，蛋白的泛素化修飾在機體的固有免疫應答中發(fā)揮重要作用。TRIM屬于E3泛素連接酶的一個家族，在人類中包含70多個成員，結構上高度保守。TRIM家族涉及多種的生物學過程，比如細胞凋亡、細胞分化、發(fā)育、腫瘤發(fā)生等。近年來研究表明，TRIM家族參與天然免疫特別是抗病毒天然免疫調控。本文主要對TRIM家族在天然免疫信號轉導方面新的研究進展進行簡要綜述。

1　TRIM家族蛋白結構

TRIM家族在結構上高度保守，從N端到C端3個保守的結構域依次是RING結構域(RING domain)、1個或2個B-box結構域(B-box domain)、一個卷曲螺旋結構域(Coiled-coil domain)，此外該家族還具有一個可變的C-末端，因此TRIM家族也稱為RBCC家族。家庭成員缺乏RBCC基序中任何結構域之一，其他結構域在順序和空間上仍是保守的。分析這些結構域的結構特征能夠增加我們對于TRIM蛋白功能的理解。

RING 結構域，一般都始于N端的，包含有40～60個氨基酸殘基，是一種能夠結合2個鋅原子的鋅指結構域，富含半胱氨酸和組氨酸，在功能上具有 E3泛素連接酶活性，可以介導蛋白自身或不同底物的泛素化[1]。研究表明有些TRIM蛋白的RING結構域可以提高蛋白的穩(wěn)定性。

B-box結構域同樣是一種能夠結合鋅離子的結構域，有B1和 B2兩種類型。二者的不同之處在于保守的半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)目和空間位置不同。B-box只在TRIM蛋白中發(fā)現(xiàn)，極有可能是該家族中重要的決定簇。

卷曲螺旋結構域(Coiled-coil)，是由多個α-螺旋相互纏繞組成的典型超二級結構。該結構域主要介導TRIM蛋白以及TRIM蛋白和其他蛋白之間的同源或異源的寡聚作用，促進大分子聚合體的形成，另外還能決定TRIM蛋白的亞細胞定位。

TRIM 家族蛋白通常在RBCC結構域后會有不同長度和組成的一個或兩個C 端結構域。PRY-SPRY是TRIM家族C端最為常見的結構域。61個氨基酸殘基PRY和140個氨基酸殘基的 SPRY融合在一起形成 B30.2 結構域，該結構域可能參與蛋白和蛋白的相互作用[2]。

2　TRIM蛋白調控天然免疫信號轉導

2.1　TRIM蛋白與TLR信號通路

目前為止，科學家已經(jīng)在人和鼠中分別發(fā)現(xiàn)了10和12個不同的TLRs，它們主要表達在巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞上。TLRs識別相應的配體后，通過其胞內的TIR結構域募集MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88)和TRIF(TIR domain-containingadapter inducing interferon-β)。MyD88通過下游一系列信號轉導活化TAK1(TGF-activated kinase 1)，TAK1進而活化IκB激酶(IKK)復合物，IKK復合物活化NF-κB通路，啟動炎癥反應。另外TLR3/4還可以通過TRIF通路，活化轉錄因子IRF(IFN-regulatory factor)促進I干擾素的產生。

(3)將位于人行橫道上游10 m的公交停靠站移至人行橫道下游處，減少行人過街的視線阻礙，同時也能減緩此處的人流擁堵現(xiàn)象。

TRIM5HIV-1病毒核心蛋白進入靶細胞后，誘導TRIM5二聚化，并且形成一個6聚體格結構。在UBC13-UEV1A的參與下，TRIM5合成非錨定的K63連接的泛素化鏈，TAB2(TAK1-associated Ub-binding protein 2)識別K63的泛素鏈，進而發(fā)生自身多聚化，激活TAK1，促進NF-κB信號通路活化[3]。

TRIM9 NF-κB結合蛋白IκBα降解以及前體蛋白P100的剪接分別在經(jīng)典和非經(jīng)典NF-κB通路中都發(fā)揮重要作用。β-轉導重復蛋白(β-TrCP)是其E3泛素連接酶Skp-Cullin-F-box復合體的一部分，可以識別IκBα和P100，進而促進IκBα的蛋白酶體降解以及P100的剪接。因此β-TrCP在經(jīng)典和非經(jīng)典NF-κB通路中都發(fā)揮重要作用。TRIM9是神經(jīng)元特異性TRIM蛋白，通過與β-TrCP的WD40結構域結合，阻止了β-TrCP與底物的結合，從而抑制IκBα降解以及P100的剪接，最終抑制NF-κB活性[4]。

TRIM22在巨噬細胞中，有研究發(fā)現(xiàn)過表達TRIM22可以激活NF-κB報告基因活性，并且過表達TRIM22能夠促進炎性細胞因子的分泌，表明TRIM22能夠促進NF-κB通路的活化。然而，Qiu等發(fā)現(xiàn)在293T細胞中，過表達TRIM22抑制TRAF6介導的NF-κB信號通路的活化，其機制是TRIM22降低TRAF6的自泛素化，誘導TAB2的降解，最終導致TRAF6介導的NF-κB通路的抑制[5]。為了明確TRIM22在NF-κB信號通路中的作用，仍然需要通過TRIM22敲基因鼠或者通過CRISPR技術敲除細胞系來實現(xiàn)。

TRIM23有研究表明人巨細胞病毒(HCMV)基因產物UL144以TRAF6依賴的方式激活NF-κB，促進趨化因子CCL22的表達。TRIM 23 存在一個Rab受體結構域，可以與UL144直接結合，從而促進TRAF6定位于核周，與UL144結合，介導的NF-κB的活化[6]。另外，在TLR3通路中，TRIM23可以通過K27連接的多聚泛素化作用于NEMO，從而促進TLR3介導的抗病毒作用[7]。

TRIM30α其產生依賴于NF-κB信號通路的活化，可與TAB2-TAB3復合物相互作用，抑制TRAF6的自身泛素化，抑制TRAF6誘導的NF-κB活化。因此，TRIM30α作為一個反饋機制來調節(jié)TLR介導的NF-κB的活化[8]。

TRIM38TLRs識別PAMP，招募MyD88，促進TRAF6和TAK1的活化，導致NF-κB和MAPK信號通路的活化。Zhao等發(fā)現(xiàn)TRIM38可以與TRAF6結合，隨后介導TRAF6的K48連接的多聚泛素化，最終被蛋白酶體降解[9]。另外，TRIM38還能夠與TAK1結合蛋白 TAB2 / TAB3相互作用，以不依賴于泛素的溶酶體途徑降解TAB2和 TAB3[10]。

2.2　TRIM蛋白與RLR信號通路

對于外源RNA，胞內RIG-I識別帶有5′三磷酸的病毒RNA，而MDA5識別長鏈RNA。在識別RNA后，RIG-I/MDA5發(fā)生構象改變，將信號傳遞給線粒體抗病毒信號蛋白MAVS。激活的MAVS招募TRAF3、 TRADD等形成信號復合體，然后激活TBK1?；罨腡BK1磷酸化IRF3，IRF3發(fā)生二聚化，進入細胞核誘I型干擾素的表達。

TRIM11高表達TRIM11可以明顯抑制IRF3的磷酸化和二聚化以及IFN-β的產生，因此細胞中病毒的復制增加。而敲除后，則作用相反。進一步研究顯示，TRIM11通過其CC結構域與TBK1的CC2結構域相互作用，而TBK1結合蛋白NAP1、SINTBAD、TANK能夠增強它們的相互作用[11]。

TRIM13TRIM13可以特異性與MDA5相互作用并通過MDA5負向調控IRF3介導的IFN產生，腦心肌炎病毒(EMCV)可以被MDA5識別，EMCV感染的TRIM13敲基因小鼠產生大量的I型干擾素并且小鼠存活率明顯增加。但是，SeV(主要被RIG-I識別)感染后，TRIM13敲基因小鼠和對照小鼠I型干擾素表達沒有明顯差異[12]。

TRIM14定位于線粒體外膜上，可以與MAVS相互結合。病毒入侵時，TRIM14經(jīng)歷K63位多聚泛素化，招募NEMO到MAVS信號小體，進而促進IRF3和NF-κB活化，促進I型干擾素的表達[13]。

TRIM26有研究表明，病毒感染可以促進TRIM26的核易位，與核內的IRF3結合，降解核內的IRF3，負調IFN-β生產和抗病毒反應[14]。Ram等發(fā)現(xiàn)在RNA病毒刺激后，TRIM26通過其自身的K27泛素化募集NEMO，結合并活化TBK1，繼而活化下游的IRF3，從而正向調節(jié)IFN-β生產[15]。這兩個相反的結果說明TRIM26在機體早期和晚期的抗病毒反應作用是不同的，為了進一步明確TRIM26的功能需要通過敲基因小鼠來完成。

TRIM31在RNA病毒感染時，TRIM31被招募至線粒體上，通過C端結構域與MAVS的N端結構域結合，并對MAVS進行K63多聚泛素化修飾，促進MAVS多聚化的形成，活化下游IRF3，從而抵御病毒入侵[16]。

TRIM38Zhao等[9]研究顯示，利用siRNA敲低TRIM38，IFN-β的表達明顯增強。通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，TRIM38可以與NF-κB活化激酶相關蛋白1結合(NAP1)，介導NAP1 的K48連接的多聚泛素化并將其降解，最終負向調節(jié)RIG-I介導的IFN-β信號通路。

TRIM65Lang等研究發(fā)現(xiàn)，TRIM65缺失后， MDA5活化劑以及EMCV誘導的I型干擾素的表達明顯下降，但是對RIG-I、TRL3以及cGAS信號通路沒有影響。進一步研究證明，TRIM65促進MDA5信號通路是通過對其K743進行K63的泛素化修飾，從而促進MDA5的寡聚化及活化[17]。

2.3　TRIM蛋白與DNA受體介導的信號通路

能夠識別外源DNA的分子統(tǒng)稱為DNA受體，例如cGAS、Mre11、 IFI16(p204)、 DDX41等。cGAS作為最重要的DNA受體，結合DNA后，催化合成第二信使cGAMP，cGAMP結合內質網(wǎng)上的STING， STING迅速二聚化，然后從內質網(wǎng)經(jīng)過高爾基體轉移到核外周小體上，激活TBK1，進而TBK1磷酸化IRF3，磷酸化的IRF3進入細胞核，從而誘導靶基因的表達。

TRIM14有研究發(fā)現(xiàn)，TRIM14除了參與RLR通路外，TRIM14也參與cGAS介導的DNA信號通路。HSV-1感染后，誘導TRIM14表達，進一步TRIM14募集USP14(Ubiquitin-Specific Protease14)對cGAS K414多聚泛素化鏈進行剪切，進而抑制cGAS通過自噬的降解[18]。

TRIM21在髓系DC中，DDX41是識別胞內雙鏈DNA的傳感器，通過下游的STING引發(fā)I型干擾素的應答反應。TRIM21通過SPRY-PRY結構域與DDX41的DEADc結構域結合，使 DDX41的9位和115位的賴氨酸發(fā)生K48連接的多聚泛素化，降解DDX41，從而負向調節(jié)胞內雙鏈DNA引起的固有免疫應答[19]。

TRIM38在對DNA信號通路研究中發(fā)現(xiàn)，TRIM38在非感染的細胞以及感染早期可以對cGAS進行蘇素化修飾，從而阻止了cGAS的泛素化降解，此外在感染早期TRIM38也可以蘇素化修飾STING，從而促進了STING活化，以及下游基因的表達。這些結果提示，TRIM38在cGAS介導的DNA信號通路中起著重要的作用[20]。

TRIM56在HEK293細胞中過表達TRIM56可以明顯增強IFN-β啟動子活性，其機制主要是對STING進行K63連接的多聚泛素化修飾，進而引發(fā)STING的二聚化，二聚化的STING招募TBK1，最終誘導I型干擾素的表達。

3　小結與展望

綜上所述，TRIM分子通過多種作用方式，在不同層次上參與調控天然免疫信號轉導。雖然不同的 TRIM分子參與天然免疫信號轉導的機制不同，但多與其 E3 泛素連接酶活性有關。目前對 TRIM 分子在固有免疫中的研究已經(jīng)取得了很大的突破，但仍有很多問題沒有解決。比如，多個TRIM分子調控一個靶分子，它們的功能是否冗余？是否有協(xié)同作用？一個TRIM分子可以調控多個天然免疫信號通路，其生理意義是什么？在病毒或細菌感染中，這些TRIM分子如何通過網(wǎng)絡作用來調節(jié)機體的免疫反應？另外TRIM 分子在不同種屬間調控信號轉導的具體分子機制是否一致還未可知，是否在適應性免疫方面發(fā)揮功能還沒見系統(tǒng)報道。超過一半的TRIM分子參與天然免疫信號的調節(jié)，包括NF-κB和IFN信號通路。除了參與炎癥通路外，NF-κB還可以通過細胞增殖和細胞凋亡的抑制作用成為致癌活化劑。因此，TRIM分子可能作為免疫應答和致癌作用的雙重調節(jié)劑。最近研究發(fā)現(xiàn)天然免疫細胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。那么TRIM家族是否通過調節(jié)天然免疫細胞的功能從而影響腫瘤的進程，需要進行深入的研究。

TRIM蛋白具有多種生物學功能，包括抗HIV，調節(jié)細胞增殖與分化，調控固有免疫、致癌、自噬等方面。因此，TRIM分子可能是連接不同信號通路或不同系統(tǒng)的節(jié)點分子。研究TRIM分子參與調控機體天然免疫調控機制，不僅可以完善天然免疫信號轉導的調控網(wǎng)絡，還為TRIM分子的其他生物學功能提供了理論基礎。同時也為抗感染藥物的設計提供新的靶點，對預防和治療人類感染性疾病具有重要意義。

[1]FREEMONT P S. Ubiquitination: ring for destruction? [J]. Current Biology, 2000, 10(2):R84-R87.

[2]GRüTTER C, BRIAND C, CAPITANI G, et al. Structure of the pryspry-domain: implications for autoinflammatory diseases [J]. FEBS Lett, 2006, 580(1):99-106.

[3]PERTEL T, HAUSMANN S, MORGER D, et al. Trim5 is an innate immune sensor for the retrovirus capsid lattice [J]. Nature, 2011, 472(7343):361-365.

[4]SHI M, CHO H, INN K S, et al. Negative regulation of nf-kappab activity by brain-specific tripartite motif protein 9 [J]. Nat Commun, 2014, 5:4820.

[5]QIU H, HUANG F, XIAO H, et al. Trim22 inhibits the traf6-stimulated nf-kappab pathway by targeting tab2 for degradation [J]. Virol Sin, 2013, 28(4):209-215.

[6]POOLE E, GROVES I, MACDONALD A, et al. Identification of trim23 as a cofactor involved in the regulation of nf-b by human cytomegalovirus [J]. J Virol, 2009, 83(8):3581-3590.

[7]ARIMOTO K, FUNAMI K, SAEKI Y, et al. Polyubiquitin conjugation to nemo by triparite motif protein 23 (trim23) is critical in antiviral defense [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(36):15856-15861.

[8]SHI M, DENG W, BI E, et al. Trim30 alpha negatively regulates tlr-mediated nf-kappa b activation by targeting tab2 and tab3 for degradation [J]. Nat Immunol, 2008, 9(4):369-377.

[9]ZHAO W, WANG L, ZHANG M, et al. E3 ubiquitin ligase tripartite motif 38 negatively regulates tlr-mediated immune responses by proteasomal degradation of tnf receptor-associated factor 6 in macrophages [J]. J Immunol, 2012, 188(6):2567-2574.

[10]HU M M, YANG Q, ZHANG J, et al. Trim38 inhibits tnfalpha and il-1beta-triggered nf-kappab activation by mediating lysosome-dependent degradation of tab2/3 [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(4):1509-1514.

[11]LEE Y, SONG B, PARK C, et al. Trim11 negatively regulates ifnb production and antiviral activity by targeting tbk1 [J]. PloS One, 2013, 8(5):e63255.

[12]NARAYAN K, WAGGONER L, PHAM S T, et al. Trim13 is a negative regulator of mda5-mediated type i interferon production [J]. J Virol, 2014, 88(18):10748-10757.

[13]ZHOU Z, JIA X, XUE Q, et al. Trim14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-i-like receptor-mediated innate immune response [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(2):E245-E254.

[14]WANG P, ZHAO W, ZHAO K, et al. Trim26 negatively regulates interferon-beta production and antiviral response through polyubiquitination and degradation of nuclear irf3 [J]. PLoS Pathog, 2015, 11(3):e1004726.

[15]RAN Y, ZHANG J, LIU L L, et al. Autoubiquitination of trim26 links tbk1 to nemo in rlr-mediated innate antiviral immune response [J]. J Mol Cell Biol, 2016, 8(1):31-43.

[16]LIU B, ZHANG M, CHU H, et al. The ubiquitin e3 ligase trim31 promotes aggregation and activation of the signaling adaptor mavs through lys63-linked polyubiquitination [J]. Nat Immunol, 2017, 18(2):214-224.

[17]LANG X, TANG T, JIN T, et al. Trim65-catalized ubiquitination is essential for mda5-mediated antiviral innate immunity [J]. J Exp Med, 2017, 214(2):459-473.

[18]CHEN M, MENG Q, QIN Y, et al. Trim14 inhibits cgas degradation mediated by selective autophagy receptor p62 to promote innate immune responses [J]. Mol Cell, 2016, 64(1):105-119.

[19]ZHANG Z, BAO M, LU N, et al. The e3 ubiquitin ligase trim21 negatively regulates the innate immune response to intracellular double-stranded DNA [J]. Nat Immunol, 2013, 14(2):172-178.

[20]HU M M, YANG Q, XIE X Q, et al. Sumoylation promotes the stability of the DNA sensor cgas and the adaptor sting to regulate the kinetics of response to DNA virus [J]. Immunity, 2016, 45(3):555-569.