抗腫瘤重組麻疹病毒疫苗研制現(xiàn)狀

李文桂，陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶400016

腫瘤是人類死亡的首位病因，腫瘤自身存在腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原，這些抗原可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在清除腫瘤的過程中發(fā)揮重要作用，這對(duì)于腫瘤疫苗的研制具有重要意義?，F(xiàn)今人們報(bào)道了腫瘤細(xì)胞的死疫苗、轉(zhuǎn)基因的腫瘤細(xì)胞疫苗、樹突細(xì)胞疫苗、抗原合成肽疫苗和腫瘤核酸疫苗等種類，這些疫苗由于自身耐受或抗原性較低等原因，免疫效果尚不理想，因此需要研制新型腫瘤疫苗。

麻疹病毒（Measles virus，MV）是麻疹的病原體，對(duì)人體具有較強(qiáng)的致病性，常用麻疹病毒的減毒株進(jìn)行免疫預(yù)防。已先后報(bào)道了麻疹病毒的Edmonston 減毒株、AIK-C 減毒株、Schwarzf88 減毒株、Moraten 減毒株、Connaught 減毒株、Alk-HDC減毒株、CAM-70 減毒株和Leningrad-1 減毒株等，這些減毒株常用于麻疹的免疫預(yù)防。Yanagi 等[1]發(fā)現(xiàn)麻疹病毒通過CD46 分子進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行繁殖，麻疹病毒感染的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞是常見的抗原遞呈細(xì)胞，可以將外源抗原傳遞至宿主的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞等，提示它有可能作為一種有希望的疫苗載體。Radecke 等[2]構(gòu)建了穿梭表達(dá)載體pTM-MVSchw-ATU2，可將外源基因插入麻疹病毒減毒株的基因組中，這為構(gòu)建重組麻疹病毒（recombinant MV，rMV）提供了有利工具。Duprex 等[3]證實(shí)麻疹病毒的減毒株可以表達(dá)綠色熒光蛋白，為構(gòu)建重組麻疹病毒提供了有力證據(jù)。國外學(xué)者報(bào)道了大量抗腫瘤的重組麻疹病毒疫苗，這些腫瘤包括多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、肝胚細(xì)胞瘤、卵巢癌、宮頸癌和乳腺癌等，我們就這方面的研制現(xiàn)狀進(jìn)行簡要綜述。

1 rMV抗多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種顱內(nèi)常見的惡性腫瘤。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是一種常見的腫瘤相關(guān)抗原，可作為治療腫瘤的靶抗原之一[4]。Pheong 等[5]將CEA 基因插入MV 的N 位點(diǎn)，構(gòu)建rMV-CEA，它可在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中復(fù)制，引起明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)。將106個(gè)U87瘤細(xì)胞顱內(nèi)注射BALB/c 裸鼠，注射后4 周發(fā)現(xiàn)腫瘤體積大于10 mm3，此時(shí)將1.8×106PFU 重組病毒采用腫瘤內(nèi)注射進(jìn)行免疫治療，每2 d 接種1次，連續(xù)接種6 次，末次免疫治療后60 d 顯示免疫組的腫瘤體積小于10 mm3，對(duì)照組為20 mm3，免疫組和對(duì)照組的存活率分別為62.5%（5/8）和25%（2/8）。

2 rMV抗多發(fā)性骨髓瘤

多發(fā)性骨髓瘤是一種播散性漿細(xì)胞惡性腫瘤。Peng 等[6,7]將1×107多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞ARH-77皮下注射SCID 小鼠，30 d 后靜脈注射105PFU 的rMV-EGFP 或表達(dá)抗CD38 單鏈抗體的rMV 進(jìn)行免疫治療，每周2 次，連續(xù)7 次，末次治療后2 周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的腫瘤組織消退，體積僅為10 mm3，而對(duì)照組為200 mm3，免疫鼠的存活時(shí)間明顯延長。

3 rMV抗前列腺癌

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤。碘化鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium iodide symporter，NIS）是甲狀腺濾泡細(xì)胞表達(dá)的膜離子通道，允許碘離子的聚集。NIS 能夠富積腫瘤組織內(nèi)的碘離子，可顯著提高123I 的放療效果[8]。Msaouel 等[9]將NIS蛋白的編碼基因插入MV 的N 位點(diǎn)構(gòu)建rMV-NIS，它可在前列腺癌的細(xì)胞株中生長，NIS 的表達(dá)可增加細(xì)胞內(nèi)的碘離子濃度。他將5×106個(gè)LNCap瘤細(xì)胞皮下注射BALB/c 裸鼠，注射后4 周腫瘤體積為100 mm3，此時(shí)靜脈注射1.5×106TCID50重組病毒進(jìn)行免疫治療，同時(shí)腹腔注射500 μCi123I 進(jìn)行同位素治療，每2 周1 次，連續(xù)7 次，末次治療后60 d 發(fā)現(xiàn)免疫加同位素治療組的腫瘤體積明顯縮小，存活率為80%（8/10），而同位素治療組的腫瘤體積繼續(xù)增大，存活率僅為20%（2/10）。

4 rMV抗腎細(xì)胞癌

腎細(xì)胞癌也是泌尿系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，可用重組病毒進(jìn)行免疫治療[10]。Meng 等[11]將麻疹病毒野生株的N/P/L 基因插入p（+）MV323 得p（+）MV2A，加入輔助質(zhì)粒pTM（N）、pTM（L）和pTM（Pnoc）共同轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞株，篩選培養(yǎng)重組病毒，發(fā)現(xiàn)該重組病毒能誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞株的凋亡，產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒作用。他將5×106A498 瘤細(xì)胞皮下注射BALB/c 裸鼠，注射后4 周檢測(cè)瘤體直徑為0.5～0.6 cm，此時(shí)將1×105TCID50重組病毒采用腫瘤內(nèi)注射進(jìn)行免疫防治，每2 d 接種1 次，連續(xù)接種10 次，末次治療后2 周免疫組的瘤體直徑為1.8 cm，對(duì)照組為5.0 cm，免疫組和對(duì)照組的存活率分別為60%（6/10）和10%（1/10）。

5 rMV抗肝胚細(xì)胞瘤

肝胚細(xì)胞瘤是兒童易患的惡性腫瘤，可用重組麻疹病毒進(jìn)行治療[12]。Zhang 等[13]將肝胚細(xì)胞瘤的CEA 基因插入MV 的N 位點(diǎn)上游，構(gòu)建rMVCEA，它能在肝胚細(xì)胞瘤的組織內(nèi)復(fù)制，誘導(dǎo)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)。隨后他將5×106Hep2G 瘤細(xì)胞皮下注射BALB/c 裸鼠，注射后4 周發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑大于0.5 cm，此時(shí)瘤體內(nèi)注射1×107TCID50的重組病毒進(jìn)行治療，每2 d 進(jìn)行1 次，連續(xù)6 次，治療后80 d 發(fā)現(xiàn)免疫組和對(duì)照組的腫瘤直徑分別為2.0 和4.5 cm，存活率分別為37.5%（3/8）和0（0/8）。

Blechacz 等[14]將5×106肝細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-3B皮下注射SCID 鼠，注射后1 個(gè)月瘤體直徑大于0.5 cm，此時(shí)靜脈注射2×106TCID50的rMV-NIS，每天1 次，連續(xù)5 d 進(jìn)行免疫治療，末次免疫治療后1 d 腹腔注射500 μCi123I 進(jìn)行同位素治療，治療后1 h 顯影成像發(fā)現(xiàn)治療鼠的腫瘤組織內(nèi)碘離子濃度升高，治療組的存活時(shí)間長達(dá)41 d，而對(duì)照組僅為15 d。

6 rMV抗卵巢癌

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的常見惡性腫瘤。Peng 等[15]將5×106卵巢癌細(xì)胞SKOV3ip.1 皮下注射裸鼠，注射后1 個(gè)月瘤體直徑約0.5 cm，此時(shí)腹腔注射107PFU 的rMV-CEA 進(jìn)行免疫治療，每2 d 1次，連續(xù)16 次，末次治療后1 d 發(fā)現(xiàn)小鼠血清CEA 水平較高，達(dá)300 ng/mL，末次治療后20 d 血清CEA 水平降至基線水平，80%（8/10）治療鼠的瘤體消退。

Galanis 等[16]將109TCID50的rMV-NIS 腹腔注射卵巢癌患者，每4 周1 次，連續(xù)6 次，末次治療后2周發(fā)現(xiàn)患者外周血單核細(xì)胞中腫瘤抗原IGFBP2特異性T 細(xì)胞增加，顯影成像發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)NIS 表達(dá)增強(qiáng)，患者的生存時(shí)間延長26.5月。

7 rMV抗宮頸癌

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)的常見惡性腫瘤。大量研究發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒16 型（Human papil?lomavirus type 16，HPV16）與人宮頸癌密切關(guān)聯(lián)。HPV16 基因組的晚期區(qū)1 編碼主要衣殼蛋白L1，該蛋白可單獨(dú)組裝成病毒樣顆粒（VLPs），具有較強(qiáng)的免疫原性。Cantarella 等[17]將HPV16 的L1 基因插入p（+）MVb2 得p（+）MVb2-L1，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MRC5 細(xì)胞，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)重組病毒表達(dá)的L1 蛋白可被患者血清識(shí)別。將1×105PFU 重組病毒腹腔注射IFNAR-/CD46+鼠，首次免疫后4 周加強(qiáng)1 次，首次免疫后6 周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清中和抗體升高，滴度為1∶10 240～1∶40 960。

8 rMV抗乳腺癌

乳腺癌是婦女內(nèi)分泌系統(tǒng)的常見惡性腫瘤。McDonald 等[18]將6×106乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 皮下注射BALB/c 鼠，注射后4 d 靜脈注射4×106TCID50的rMV-CEA，每周1 次，連續(xù)進(jìn)行3 周，末次治療后2 個(gè)月發(fā)現(xiàn)免疫組和對(duì)照組的腫瘤體積分別為100 和300 mm3，免疫組存活99 d，而對(duì)照組存活45 d。

中性粒細(xì)胞激活蛋白（neutrophil-activating protein，NAP）可充當(dāng) Toll 樣受體2（TLR2）激動(dòng)劑，促進(jìn)IL-12、IFN-γ和TNF-α釋放，增強(qiáng)Th1 應(yīng)答[19]。Iankov 等[20-22]將擴(kuò)增的NAP 基因插入p（+）MVeGFP 得p（+）MV-NAP，加入麻疹病毒的Schwarz 減毒株，采用共轉(zhuǎn)染方式轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞株，篩選重組病毒，免疫印跡發(fā)現(xiàn)重組病毒表達(dá)的NAP 蛋白可被鼠源單抗識(shí)別。他們將1×106PFU 重組病毒采用腹腔注射接種IFN-γR-/-CD46-/-轉(zhuǎn)基因鼠，發(fā)現(xiàn)血清IgG 水平在免疫后4～21 d 增加，21 d 達(dá)較高水平；免疫后35 d，經(jīng)ELISPOT 證實(shí)脾IFN-γ+SFCs 數(shù)目明顯增多；接著，將重組病毒的接種劑量減為2×105PFU，接種后18、30 和180 d 顯示血清IgG 升高，滴度分別為1∶102 400、1∶512 000 和1∶409 600，接種后4 周發(fā)現(xiàn)血清IgG1、IgG2a 和IgG2b 水平升高，IgG1 與IgG2a 比值小于1；最后，靜脈注射1×106MBA231-lu-P4 乳腺癌細(xì)胞給無胸腺裸鼠，成功制造了小鼠乳腺癌擴(kuò)散模型，建模后6 d 將1×106PFU 重組病毒采用靜脈注射的途徑進(jìn)行免疫防治，每天注射1 次，連續(xù)注射10 d，末次注射后9 d 發(fā)現(xiàn)治療組的血清IL-6 水平以及胸液TFN-α、IL-6 和IL-23 水平升高，治療組的生存時(shí)間明顯長于未治療組。

9 rMV-IL-12抗腫瘤

IL-12 可增強(qiáng)NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用并促進(jìn)LAK 和CTL 細(xì)胞生成，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺滅作用。Hoffman 等[23]將IL-12 的編碼基因插入MV 的H-L 位點(diǎn)，構(gòu)建重組MV-IL-12。將3×104PFU 疫苗肌肉注射恒河猴，免疫后7 d 發(fā)現(xiàn)免疫猴的外周血單核細(xì)胞可明顯增殖，可產(chǎn)生高水平的IL-10、低水平的IFN-γ和IL-12；血清IgG 在免疫后14～45 d 升高，免疫后21 d 達(dá)較高水平；抗體亞類分析表明IgG1 升高，免疫后21 d 達(dá)較高水平。rMV-IL-12 抗瘤試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

10 結(jié)語

重組麻疹病毒疫苗作為一種新型疫苗具有下述優(yōu)點(diǎn)：自1970年開始接種麻疹病毒的減毒株以來，已有上千億兒童進(jìn)行接種，安全有效，接種1 或2 次即可誘導(dǎo)終身免疫，接種費(fèi)用較低；麻疹病毒僅在宿主細(xì)胞的胞漿內(nèi)復(fù)制，排除了整合入宿主染色體的可能性；麻疹病毒的編碼蛋白較少，可以避免不必要的免疫應(yīng)答；重組麻疹病毒的遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，可替代常規(guī)麻疹病毒疫苗的標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行免疫接種；運(yùn)用基因剪切等手段改造靶抗原基因，可使重組麻疹病毒日趨完美；尚未發(fā)現(xiàn)重組麻疹病毒可在宿主體內(nèi)永久性存在或擴(kuò)散現(xiàn)象；麻疹病毒減毒株的接種網(wǎng)點(diǎn)多，價(jià)廉物美，大量生產(chǎn)非常容易。

該疫苗尚存在以下缺陷：外源基因的表達(dá)需特殊載體；表達(dá)蛋白的水平較低；表達(dá)產(chǎn)物可能對(duì)疫苗有害；由于缺乏蛋白修飾系統(tǒng)，不能高效合成真核蛋白；表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白存在一定差異等。

要想將重組麻疹病毒發(fā)展成為一種理想疫苗，尚須弄清下述問題：高效啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的開發(fā)利用；加入理想的分子伴侶，使外源蛋白的分泌達(dá)到較高水平；選擇合適的信號(hào)肽序列促進(jìn)蛋白前體的正確折疊和表達(dá)；如何消除重組麻疹病毒所含的抗生素抗性基因?qū)θ梭w或環(huán)境的損害；口服多價(jià)重組重組麻疹病毒的研制開發(fā)；如何選擇重組麻疹病毒的新選擇標(biāo)志；深入研究重組麻疹病毒的保護(hù)性機(jī)制。闡明這些問題，有助于提高人們對(duì)重組麻疹病毒防治腫瘤的信心。