蛇毒合成調(diào)控機制和進化研究

田靖

南部戰(zhàn)區(qū) 疾病預防控制中心，云南 昆明650031

人類對蛇毒的認識起始于原始狩獵時期使用的毒箭，古希臘時期蛇毒還被制成“萬能解毒藥”用于解毒和戰(zhàn)傷止血。隨著科技的進步，蛇毒被越來越多地應用于醫(yī)藥領(lǐng)域。蛇毒組成具有高度的復雜性和多樣性，對蛇毒研究的歷史也是人類現(xiàn)代藥理學建立的歷史。隨著“蛇毒組學”等新技術(shù)的運用，科學家們對蛇毒的成分和作用機理也有了越來越多的了解，蛇毒演化的研究也一直是遺傳學家關(guān)注的焦點。

1 蛇毒組成和功能多樣性

目前發(fā)現(xiàn)的毒蛇種類約有500 多種[1]，均屬于新蛇類（即新蛇下目），分為蝰蛇科（Viperidae）、穴蝰科（Atractaspididae）、眼鏡蛇科（Elapidae）和游蛇科（Colubridae）共4 科。

蛇毒由具有高度特異性的蛇毒腺體分泌，由大量的蛋白質(zhì)以及超過900 種多肽類物質(zhì)和代謝產(chǎn)物共同組成[2]。蛇毒蛋白的相對分子質(zhì)量為6000～10 000，可分為具有酶活性和不具有酶活性2 類，大多數(shù)蛋白和多肽都以單體形式存在，單獨發(fā)揮藥理學功能，而一部分蛋白則通過共價鍵或非共價鍵與其他蛋白形成復合物，表現(xiàn)出更強的藥理活性，大大增強毒素的致死能力[3]。電鏡觀察證實，毒素蛋白可以損傷血管壁的內(nèi)皮細胞，使內(nèi)皮細胞產(chǎn)生泡狀結(jié)構(gòu)，細胞核周圍空間膨脹，從而破壞細胞膜。多肽類物質(zhì)由2～15 個氨基酸殘基組成，在響尾蛇和蝰蛇中含量較多。蛇毒中的多肽可結(jié)合于獵物的多種受體位點[4]，選擇性作用于關(guān)鍵性酶、受體或離子通道，使其生物學功能改變，進而破壞中央和周圍神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肌肉神經(jīng)系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的平衡[5]。蛇毒代謝產(chǎn)物包括嘌呤核苷酸及堿基、神經(jīng)遞質(zhì)、胍基復合物、羧酸類化合物、胺類、單糖/雙糖類以及氨基酸等，小分子代謝產(chǎn)物可能是蛇毒致死的主要原因，而含量最高的有機代謝物檸檬酸可以阻止蛇毒的降解。

蛇毒蛋白在每個獨立科別內(nèi)同源性較高，屬于共同的蛋白家族，但一些特殊蛋白家族也在不同的蛇科普遍存在。這些毒素蛋白在氨基酸序列和豐度上存在差異，因此在不同蛇科內(nèi)發(fā)揮不同的生物學功能。例如，蝰蛇科毒素中有大量酶活物質(zhì)，影響凝血，具有輕微的神經(jīng)毒素功能；眼鏡蛇科家族毒素具有高度的神經(jīng)毒素活性；穴蝰科毒素具有各種多肽類毒性，影響心血管系統(tǒng)；游蛇蛇毒具有一些類似于蝰蛇和眼鏡蛇蛇毒的活性[6]。

2 蛇毒的合成與調(diào)控

2.1 蛇毒合成是環(huán)境適應性的昂貴代謝過程

蛇毒對于蛇類自身來說是一種珍貴的代謝產(chǎn)物，其合成過程高度消耗能量，Marshall 等對提取蛇毒后的美國蝮蛇進行了代謝率評估，發(fā)現(xiàn)在蛇毒消耗后自我補給的72 h 內(nèi)整體代謝率提高了11%[7]。對于如此珍惜的資源，蛇類在長期進化的過程中也形成了以節(jié)約的方式使用蛇毒，如響尾蛇（Echisspp.）釋放蛇毒的量是依據(jù)獵物體態(tài)大小來決定的[8]。雖然過量的毒液可以快速殺死獵物，但獵物死亡速度在提高毒蛇適應性方面是不必須的，沒有成為蛇類演化的驅(qū)動力，因此大量毒液釋放可能造成浪費，而節(jié)約使用蛇毒的方式被保留下來。

毒蛇還可以針對特定獵物生成特異性毒素，如在紅樹林蛇（Boiga dendrophila）蛇毒中分離得到針對鳥類的特有的denmotoxin 毒素[9]。

2.2 蛇毒合成調(diào)控具有周期性

蛇毒合成是一個動態(tài)調(diào)控過程，毒素成分可以隨著生活環(huán)境[10]、飲食、生長季節(jié)和發(fā)育階段[11]而改變。毒腺是改構(gòu)的腮旁腺，是毒素合成的主要部位，主要由致密折疊的分泌上皮（epithelium）和多種類型細胞組成，包括腺分泌細胞（glandu?lar secretory cell）、富含線粒體細胞（mitochondriarich cell）、橫向細胞（horizontal cell）和“黑暗”細胞（"dark" cells）等。毒蛇在釋放毒液后易變得比較脆弱，因而需要一個高效的毒素生產(chǎn)系統(tǒng)，幫助其快速恢復“武器”效能，而這些大量富集的分泌細胞在快速再合成毒素蛋白及其他組分、及時補充毒液儲備的過程中是必要的。

一個完整的毒素生產(chǎn)周期比哺乳動物唾液腺或胰腺蛋白的生產(chǎn)周期要長，分泌細胞通常經(jīng)歷由“靜止期”進入“活躍期”，再進入“靜止期”的循環(huán)過程。新毒素的合成伴隨著毒素釋放而啟動，當接受到毒素合成的刺激信號后，毒素分泌細胞開始發(fā)生一系列形態(tài)學和生物化學方面的改變。研究發(fā)現(xiàn)，在蛇毒排出至以后的8 d 時間里，可見分泌上皮細胞增大、形態(tài)發(fā)生柱狀性改變，粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、亞細胞結(jié)構(gòu)、分泌小體以及線粒體的細胞膜增加。蛇毒排出后4～8 d，分泌細胞合成活性最強，細胞內(nèi)mRNA 濃度最高，毒素蛋白的合成逐步增加并趨于穩(wěn)定，8 d 時達到峰值；隨后，細胞合成活性降低，毒素逐漸在內(nèi)腔中儲存下來，毒腺重新回到“靜止期”，直到下一次毒素合成激活。

2.3 蛇毒合成的不同步性

Currier 等的研究顯示，蛇毒合成在某些方面是穩(wěn)定遺傳的，可能存在高度調(diào)控機制以確保蛇毒可以快速合成[12]。毒素生產(chǎn)周期中關(guān)鍵性毒素是在毒素合成起始階段同步合成的。通過分析靜止期、蛇毒抽取后0～1、0～3、0～7 d 主要毒素成分及蛇毒中的mRNA 發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵毒素mRNA 的表達在毒液釋放后立刻處于全面活躍狀態(tài)，并在3～7 d 達到轉(zhuǎn)錄高峰。利用反向HPLC-Mass 檢測關(guān)鍵毒素蛋白的表達，主要毒素成分在毒素釋放后迅速表達，含量和相對組成在毒素合成周期內(nèi)較為穩(wěn)定，并且初期合成毒素的活性與成熟毒素活性沒有顯著性差異。

有研究則認為，不同毒素在不同時間表達譜具有差異[13]，并非所有蛋白均在激活期合成[14]，說明不同毒素具有非同步合成的特點。毒腺處于“靜止期”或“激活期”時，毒素蛋白的種類是不完全相同的。毒腺的“靜止期”也已發(fā)現(xiàn)了絕大多數(shù)毒素蛋白種類，如富含半胱氨酸分泌蛋白（cys?teine-rich secretory protein，CRISP）、蛇毒金屬蛋白酶（snake venom metalloproteinase，SVMP）、磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）、L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase，LAAO）和解聚素（disinteg?rin）等。不僅如此，“靜止期”還表達一些特異的蛋白，如C 型凝集素蛋白（C-type lectin proteins，CTL）和蛇毒絲氨酸蛋白酶（snake venom serine proteinase，SVSP）等在“靜止期”的含量較“激活期”更為豐富，GPⅠb-BP 和促凝因子Ⅸ/Ⅹ蛋白則只在“靜止期”出現(xiàn)，在蛇毒提取后1 d 這些蛋白就不再被檢出?！办o止期”的絕大多數(shù)毒素蛋白進入“激活期”后，表達更為活躍，蛋白種類也更為豐富。

毒腺中的非毒素蛋白可能與毒素蛋白的合成速度調(diào)控模式相關(guān)。在毒腺“靜止期”，細胞質(zhì)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的合成種類增加，可能與毒素的合成和分泌過程相關(guān)。在毒腺“激活期”，與毒素分泌細胞合成和釋放功能相關(guān)的蛋白質(zhì)合成增加：如肌動蛋白等細胞骨架蛋白增多，與淀粉酶分泌相關(guān)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白二硫鍵異構(gòu)酶表達增高，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新合成蛋白的二硫鍵修飾和蛋白質(zhì)的正確折疊有關(guān)；核糖體合成增加與蛋白合成、與mRNA 和tRNA 的轉(zhuǎn)錄起始相關(guān)；硫氧還蛋白的合成可能在特異蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾及蛋白相互作用等方面具有重要功能等。這些非毒素相關(guān)蛋白在“激活期”合成，保證了新蛋白和新毒素的合成、正確折疊、對細胞骨架的識別、正確的結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄后的修飾等，在毒素合成和調(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用。

2.4 毒素合成的轉(zhuǎn)錄后修飾

蛇毒中的mRNA 可以在蛇毒中異常穩(wěn)定地存在，即使在含核酸酶及磷酸二脂酶的環(huán)境中也不被降解[15]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌的微孔狀小體（microvesicu?lar bodies）可能對RNA 具有保護作用。毒素的合成是蛇類毒腺的復雜代謝過程，比較合理的推測是，毒素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄很可能在毒腺“靜止期”就存在了，但調(diào)控卻進一步發(fā)生在毒素生產(chǎn)周期的后續(xù)階段。蛇毒中大范圍識別到金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，表明蛋白酶處理以及轉(zhuǎn)錄后修飾的發(fā)生。

不同的胞外信號肽誘導基因表達不同毒素，通過miRNA 調(diào)控mRNA 的翻譯[16]，使得不同毒素可以非同步合成并獨立分泌[17]，以避免細胞在同一時間生產(chǎn)所有毒素而造成壓力。

3 蛇毒的演化機制探討

自然界中動物毒素的功能主要是捕獵和防御。比如，蜜蜂及某些魚類的毒素主要發(fā)揮防御功能，防御性毒素是簡化和高度保守的，其主要作用是造成快速的、局部的劇痛；而捕食性毒素則更加復雜，在組成和生理學作用方面具有多樣性[18]。食肉錐型蝸牛（cone snails）[19]能在捕獵和防御模式間迅速轉(zhuǎn)化其毒素組分，毒素成分依據(jù)蝸牛的作用對象而調(diào)整：由防御引發(fā)的毒素包含大量癱瘓性毒素，作用于神經(jīng)肌肉受體，能引起人體病理反應，對人類具有致死性；而由捕獵引發(fā)的毒素對于大多數(shù)人源性靶標則沒有活性，不能引起人類病理反應。

蛇毒的進化至少有6000 萬年[19]到1 億7000 萬年的歷史[20]，是迄今研究最深入的生物毒素系統(tǒng)。蛇毒對于蛇類具有捕食獵物和防御的雙重作用，捕食獵物是蛇毒的首要功能。蛇類為了能夠在特定環(huán)境（特別是食物）下生存，須與獵物相互角逐、相互影響、共同進化：一方面，獵物期望可以逃脫蛇毒的作用，免于被蛇類捕殺，進化出一些對毒素具有抗體的物質(zhì)；另一方面，蛇類為了提高對生存環(huán)境的適應性，不斷優(yōu)化調(diào)整毒素組成，以最少量、最有效的毒素消耗為代價達到捕獲獵物的目的，毒素與獵物之間的“軍備競賽”持續(xù)進行。北太平洋響尾蛇（Crotalus o.orega?nus）的主要獵物是加利福尼亞松鼠（Otospermophi?lus beecheyi），Matthew 發(fā)現(xiàn)，松鼠血液中存在一種可以與蛇毒金屬蛋白酶結(jié)合的物質(zhì)，使松鼠具備了一種天然抵抗蛇毒毒素的能力，而這種抗性是可以隨著地理差異的改變和蛇毒毒素成分的改變而調(diào)整的[21]。

生物毒素體現(xiàn)了生物的適應性，是趨異進化（divergent evolution）和趨同進化（convergent evo?lution）的很好的例子[20,22]。一些毒素基因被認為來源于參與重要的調(diào)控過程或具有生物活性的生理性蛋白基因的復制，并在毒腺中選擇性表達。一旦某個特殊的基因被招募到毒腺中，額外的基因復制發(fā)生，使得蛋白具有新功能或亞功能化，典型的可以產(chǎn)生大量的多位點基因家族，編碼不同功能和活性的毒素。同時，毒素也可以反向地從毒腺招募到正常組織中，一些毒素種類被發(fā)現(xiàn)在毒腺和組織中同時表達[23]。與組織中的酶類物質(zhì)進化不同，蛇毒外顯子的進化速度明顯快于內(nèi)顯子[24]，快速進化的殘基大多位于分子表面，以控制與靶標獵物體內(nèi)的分子相互作用[25]。然而，毒素整體的進化速度是與毒素蛋白的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的豐度相關(guān)的，高濃度的蛋白更可能被正向選擇[26]。

毒素基因通過基因復制和加速進化的方式賦予毒素新的或協(xié)同的功能[27]，是新毒素基因進化的主要模型，但這一過程同時也可以反向進行。Casewell 等認為，基因缺失可以改變蛇毒的生物活性，從而使毒素更適應環(huán)境[1]。Martinson等認為，毒素表達的缺失并非是基因的降解，而是由順式調(diào)控原件調(diào)節(jié)造成的基因表達下降引起的[28]。

現(xiàn)代科學技術(shù)的發(fā)展擴展了蛇毒研究的廣度和深度，取得了令人欣喜的成就，但是還有很多問題尚未完全明晰。隨著研究的不斷深入，對蛇毒組成、合成機制以及毒素生物演化機制還會有新的發(fā)現(xiàn)，這將有助于人類對蛇毒的利用，更好地揭示生命奧秘。