表皮生長因子對缺氧缺糖模型大鼠骨骼肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

許雪梅，黃笑夏，金　甌，張海鄰，時洪雪

(1.浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，浙江 溫州 325000；2.浙江省溫州市中醫(yī)院藥劑科，浙江 溫州 325000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科，浙江 溫州 325000; 4.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)系，浙江 溫州 325000)

壓瘡深部組織損傷(deep tissue injury，DTI)是壓瘡中最嚴(yán)重類型，好發(fā)于受壓骨隆突處，是臨床護(hù)理工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)[1]。DTI可有皮膚深部組織肌層損傷，局部持續(xù)受壓時，由于血流灌注受阻、大量自由基產(chǎn)生造成肌細(xì)胞損傷。近年研究[2-3]顯示: 氧化應(yīng)激、凋亡及炎性反應(yīng)在壓瘡的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要促進(jìn)作用，尤其缺血缺氧損傷產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致細(xì)胞損傷及凋亡的重要機(jī)制，也是發(fā)展為DTI的重要因素。因此抑制氧化應(yīng)激是治療DTI的關(guān)鍵。表皮生長因子(epithelial growth factor,EGF)是一種重要的細(xì)胞生長因子，具有明顯的促增殖抗氧化及抗凋亡作用[5-6]。有研究[7]顯示：給予EGF局部浸潤對糖尿病足具有明顯的改善作用，但是EGF是否對壓瘡的深部組織尤其是肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用尚未見報道。因此，本研究構(gòu)建大鼠骨骼肌細(xì)胞缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型，觀察OGD對骨骼肌細(xì)胞損傷的影響以及EGF的保護(hù)機(jī)制，以期為臨床壓瘡DTI的修復(fù)提供良好的治療策略。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器大鼠骨骼肌L6成肌細(xì)胞(上海中科院研究所)。DMDM培養(yǎng)液和新生牛血清(美國Hyclone公司)，PI-FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，羅丹明123和EGF(美國Sigma公司)，Western blotting蛋白檢測一抗抗體(美國Abcam公司)，二抗抗體(美國Thermo公司)。高速低溫離心機(jī)(美國Sigma公司)，倒置光學(xué)顯微鏡(北京恒奧德儀表有限公司)， 流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞培養(yǎng)大鼠骨骼肌L6細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，高糖 DMDM培養(yǎng)液，pH7.4)中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d用0.25%胰酶消化后，換液傳代培養(yǎng)。

1.3亞甲基四唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞生存率取對數(shù)生長期大鼠骨骼肌細(xì)胞，經(jīng)消化制成細(xì)胞懸液，以每孔100 μL、1×104個細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗分為正常對照組、OGD組、5 μg·L-1EGF +OGD組、10 μg·L-1EGF +OGD組和20 μg·L-1EGF+OGD組。正常組細(xì)胞放置于常氧培養(yǎng)箱(20% O2，DMEM常規(guī)培養(yǎng))中。OGD組和EGF+OGD組細(xì)胞培養(yǎng)液換成無糖的DMEM培養(yǎng)液后分別加入不同濃度(5、10和20 μg·L-1) EGF，孵育16 h后，放入低氧培養(yǎng)箱(1% O2)。在20 h后加入MTT (5 g·L-1) 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，于570 nm處測其吸光度(A)值。實(shí)驗重復(fù)3次。細(xì)胞生存率=(實(shí)驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率取對數(shù)生長期大鼠骨骼肌細(xì)胞，經(jīng)消化制成細(xì)胞懸液，以每瓶5×106個細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，根據(jù)實(shí)驗分組，加入不同濃度EGF (5、10和20 μg·L-1)，放于低氧培養(yǎng)箱，24 h后用PBS洗2次，收集細(xì)胞，棄上清，分別加入終濃度1 mg·L-1的 PI和Annexin Ⅴ-FITC，37℃孵育15 min，PBS洗2次，流式細(xì)胞儀檢測各組樣品每10 000個細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.5DCFH-DA試劑盒檢測細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen specics,ROS)水平取對數(shù)生長期大鼠骨骼肌細(xì)胞，按照實(shí)驗分組加藥處理后，分別放于常氧和低氧培養(yǎng)箱，24 h后用PBS洗2次，隨后加入無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol·L-1，放于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀(485 nm激發(fā)和535 nm發(fā)射波長)進(jìn)行檢測。實(shí)驗重復(fù)3次。計算每組的平均熒光值，設(shè)定正常對照組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為100%。

1.6線粒體膜電勢測定取對數(shù)生長期大鼠骨骼肌細(xì)胞，按照上述方法分組，加入藥物后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)后，加入10 μmol·L-1Rhodamine 123后，放于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。使用PBS洗3次，15 min后，應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。計算每組的平均熒光值，設(shè)定正常對照組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為100%。

1.7蛋白免疫印跡檢測細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)收集細(xì)胞，提取細(xì)胞胞漿蛋白，Bio-Rad 法測定蛋白表達(dá)水平。取蛋白60 μg行SDS-PAGE電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上。膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗3次，加入抗Bcl-2 (1∶1 000) 和Bax抗體(1∶500)，4℃過夜。PBST洗3 次,相應(yīng)加入過氧化物酶標(biāo)記二抗，放在脫色搖床搖1 h，PBST 洗3 次。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。以β-actin為內(nèi)參蛋白，實(shí)驗重復(fù)3 次。蛋白表達(dá)水平=待測蛋白灰度值/β-actin 蛋白灰度值。

2　結(jié)　果

2.1各組骨骼肌細(xì)胞生存率和凋亡率MTT法檢測結(jié)果顯示：與正常對照組比較，OGD 24 h時OGD組骨骼肌細(xì)胞生存率明顯下降(P<0.01)；與OGD組比較，不同濃度EGF組骨骼肌細(xì)胞生存率升高，其中10和20 μg·L-1EGF組骨骼肌細(xì)胞生存率明顯升高(P<0.05或P<0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：與正常對照組比較，OGD 24 h時OGD組骨骼肌細(xì)胞凋亡率明顯升高 (P<0.01)；與OGD組比較，10和20 μg·L-1EGF+OGD組骨骼肌細(xì)胞凋亡率明顯降低 (P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1各組大鼠骨骼肌細(xì)胞生存率和凋亡率

GroupSurvivalrateApoptoticrateNormalcontrol100．00±4．514．10±0．92OGD80．10±7．65?18．20±2．16?EGF(5μg·L-1)+OGD82．00±6．6316．90±1．23EGF(10μg·L-1)+OGD89．70±5．16△13．20±2．31△EGF(20μg·L-1)+OGD93．30±3．82△△8．60±2．43△△

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;△P<0.05,△△P<0.01vsOGD group.

2.2各組骨骼肌細(xì)胞中ROS水平和線粒體膜電勢DCFH-DA檢測細(xì)胞中ROS水平結(jié)果顯示：與正常對照組比較，OGD 24 h時OGD組骨骼肌細(xì)胞中ROS水平明顯升高 (P<0.01)；與OGD組比較，不同濃度EGF組骨骼肌細(xì)胞中ROS水平明顯降低 (P<0.05或P<0.01)，并呈濃度依賴性。流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電勢結(jié)果顯示：與正常對照組比較，OGD組細(xì)胞線粒體膜電勢明顯下降(P<0.01)；與OGD組比較，不同濃度EGF組細(xì)胞線粒體膜電勢明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2各組大鼠骨骼肌細(xì)胞中ROS水平和線粒體膜電勢

GroupROSlevelRelativeRho123fluoresenceintensityNormalcontrol100．00±4．69100．00±2．83OGD193．20±7．38??53．60±9．61?EGF(5μg·L-1)+OGD175．60±3．6759．30±4．92EGF(10μg·L-1)+OGD162．10±6．80△73．60±3．32△EGF(20μg·L-1)+OGD129．30±4．35△△87．45±1．99△△

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;△P<0.05,△△P<0.01vsOGD group.

2.3各組骨骼肌細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)水平Western blotting法檢測結(jié)果顯示：與正常對照組比較，OGD 24 h時OGD組骨骼肌細(xì)胞中線粒體膜蛋白Bax表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-2/Bax比值明顯下降(P<0.01)；與OGD組比較，各濃度EGF組Bax蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2/Bax比值升高，并具有濃度依賴性，尤其10和20 μg·L-1EGF+OGD組效果明顯(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

Lane 1:Normal control group;Lane 2:OGD group;Lane 3:5 μg·L-1EGF+OGD group;Lane 4:10 μg·L-1EGF+OGD group;Lane 5:20 μg·L-1EGF+OGD group.*P<0.01vsnormal control group;ΔP<0.05 ;ΔΔP<0.01vsOGD group.

圖1各組大鼠骨骼肌細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)電泳圖(A)和Bcl-2/Bax比值直條圖(B)

Fig.1Electrophoregram of expressions of Bcl-2 and Bax proteins in skeletal muscle cells(A) and histogram of ratios of Bcl-2/Bax(B) of rats in various groups

3　討　論

DTI是一類危害嚴(yán)重的深部組織慢性難愈性潰瘍,主要發(fā)生在急危重癥及長期臥床患者，主要累及皮膚全層，伴有骨骼肌腱及肌肉的損傷[8]。近些年來研究[9-10]發(fā)現(xiàn)：DTI并非急性高壓力性損傷，而是由間歇性較低壓力重復(fù)作用造成的局部不完全缺血缺氧損傷，由此生成的氧自由基持續(xù)反應(yīng)造成肌細(xì)胞線粒體損傷、DNA斷裂和脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)。缺血缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激進(jìn)而引起的線粒體損傷導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞損傷及進(jìn)一步的肌組織降解，是DTI形成的關(guān)鍵。研究[11-12]顯示：肢體不同組織對缺血缺氧的耐受性不同，骨骼肌細(xì)胞對缺血缺氧損傷最為敏感，缺血4～6 h即可發(fā)生不可逆損傷，而肌組織損傷的同時又會發(fā)生一系列的細(xì)胞因子水平改變，導(dǎo)致組織再生障礙，因此分析壓瘡深部組織骨骼肌細(xì)胞損傷和修復(fù)機(jī)制尤為重要。本實(shí)驗建立大鼠骨骼肌細(xì)胞OGD模型，在細(xì)胞水平上模擬壓瘡動物模型，觀察骨骼肌細(xì)胞損傷過程中病理生理學(xué)的微觀改變，可為壓瘡深部骨骼肌細(xì)胞損傷研究提供新思路。

壓瘡早期深部組織骨骼肌細(xì)胞減少不易被發(fā)現(xiàn)，而后期肌細(xì)胞活性及生長率降低可能是壓瘡惡性難愈的重要因素[13]。本實(shí)驗采用MTT法檢測細(xì)胞活性，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)OGD增加了骨骼肌細(xì)胞凋亡，但是其損傷機(jī)制尚不明確。有研究[14]顯示線粒體損傷在真核細(xì)胞凋亡過程中具有重要的樞紐作用。在OGD時，線粒體膜通透性增加，膜電勢發(fā)生改變，ROS水平改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。在利用果糖模擬Ⅱ型糖尿病肌細(xì)胞損傷模型中，氧化應(yīng)激和Bcl-2家族成員水平的變化，是骨骼肌細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素[16]。棕櫚酸鹽誘導(dǎo)的L6細(xì)胞線粒體DNA損傷模型中，典型的變化也與氧化應(yīng)激和線粒體功能改變密切相關(guān)[17]。本實(shí)驗中流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：OGD能明顯增加骨骼肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平。同時，羅丹明123檢測線粒體膜電勢結(jié)果表明OGD降低了骨骼肌細(xì)胞膜電勢。Western blotting檢測結(jié)果顯示：OGD明顯降低Bcl-2/Bax比值，且降低骨骼肌細(xì)胞的抗凋亡能力。由此可見，OGD通過激活ROS、損傷線粒體功能引起大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡，這可能是壓瘡肌組織損傷的關(guān)鍵因素之一。

EGF是一種廣泛存在于體液和多種腺體的生物活性肽類[18]。研究[19]顯示：EGF可刺激多種細(xì)胞的增殖，包括表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等；在燙傷及手術(shù)等創(chuàng)面的修復(fù)和愈合方面取得良好療效。在EGF保護(hù)酒精引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中，線粒體中Bcl-2和Bax表達(dá)改變是其保護(hù)效應(yīng)的關(guān)鍵，進(jìn)而能夠調(diào)控下游的TNF-α和NF-κB等炎癥因子的水平[20]。但是關(guān)于EGF與介導(dǎo)壓瘡DTI的機(jī)制還不明確。本研究結(jié)果證實(shí): 給予不同濃度EGF時，OGD引起的細(xì)胞生存率下降明顯上升，凋亡率也明顯下降，并具有濃度依賴性，提示EGF具有明顯的細(xì)胞損傷保護(hù)效應(yīng)；DCFH-DA檢測結(jié)果表明：不同濃度EGF明顯降低OGD引起ROS水平增加,并且改善了膜電勢水平的降低；Western blotting法檢測結(jié)果表明：EGF明顯增加了Bcl-2/Bax的比值。以上結(jié)果說明：EGF的保護(hù)機(jī)制可能與降低OGD引起的細(xì)胞中ROS水平增加及保護(hù)線粒體功能有關(guān)，可能是EGF在DTI和難愈性潰瘍中發(fā)揮促進(jìn)修復(fù)作用的主要機(jī)制。

本實(shí)驗以骨骼肌L6成肌細(xì)胞為基礎(chǔ)，通過OGD因素來模擬DTI病理生理過程，骨骼肌細(xì)胞在OGD 24 h后生存率降低，細(xì)胞凋亡明顯，ROS水平增加，線粒體膜電勢水平下降，Bcl-2/Bax比值明顯降低。當(dāng)提前給予不同濃度EGF時，通過降低ROS水平、保護(hù)線粒體功能來改善OGD引起的生存率下降，進(jìn)而發(fā)揮抗骨骼肌細(xì)胞凋亡的作用。本文作者推測：EGF可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和線粒體凋亡途徑緩解以肌細(xì)胞受累為主的大鼠壓瘡DTI，本研究結(jié)果為臨床DTI的治療和研究提供了新的思路。

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