誘導(dǎo)多能干細胞治療頸節(jié)段脊髓損傷的研究進展

楊 超 綜述 申才良 審校

脊髓損傷是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。原發(fā)創(chuàng)傷導(dǎo)致脈管系統(tǒng)的破壞、呼吸困難、神經(jīng)性休克、炎癥及離子和神經(jīng)遞質(zhì)水平的改變，隨后導(dǎo)致機體進入繼發(fā)性損傷期[1]。臨床上頸部脊髓損傷患者占脊髓損傷的大部分比例，但80%脊髓損傷實驗均選擇胸正中節(jié)段損傷模型進行研究[2]。雖然兩者在病理生理學(xué)水平上很相似，但治療方法和功能恢復(fù)則不盡相同。在解剖學(xué)方面，頸節(jié)段損傷的特征是白質(zhì)中上行和下行軸突束的離斷以及灰質(zhì)中實質(zhì)細胞的丟失；而在胸節(jié)段中損傷僅涉及白質(zhì)。這表明胸、頸節(jié)段損傷引起的運動功能障礙不完全相同。van Hedel et al[3]報道C5/C6損傷患者經(jīng)修復(fù)可以明顯改善運動功能，而單一胸節(jié)段損傷修復(fù)可能達不到上述良好效果。有研究[4]表明胸節(jié)段損傷模型不能完全替代頸節(jié)段損傷模型。因此頸部脊髓損傷研究和治療有其特殊性。

脊髓損傷傳統(tǒng)的治療包括激素治療和手術(shù)治療。激素治療中的甲強龍最初應(yīng)用于臨床[5]，但之后又有許多學(xué)者對其效果產(chǎn)生爭論[6]。手術(shù)治療雖可以減輕脊髓損傷的早期壓迫，有效防止繼發(fā)性損傷，但治療效果有限[7]?，F(xiàn)在生物治療逐步發(fā)展，在一些動物實驗和臨床實驗中，經(jīng)細胞移植治療脊髓損傷法可以改善損傷微環(huán)境、提升再生能力及阻止病變進一步惡化[8]。近十年來，移植神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的治療方法取得了巨大進展并且一些已應(yīng)用于臨床。最近，誘導(dǎo)多能干細胞成為國內(nèi)外研究的熱點，該文將綜述誘導(dǎo)多能干細胞治療頸節(jié)段脊髓損傷的最新進展。

1 干細胞移植治療

1.1背景干細胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞，在特定的生理條件下可以分化成特定的細胞系譜。胚胎干細胞是從早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細胞，具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特征。間充質(zhì)干細胞主要來自于骨髓、脂肪組織、臍帶組織及臼齒等部位，具有多向分化潛能。誘導(dǎo)多能干細胞是體細胞經(jīng)重編程得到的類似胚胎干細胞的細胞，具有多能性。各自優(yōu)缺點見表1。

1.2MSCs和ESCs移植治療的研究現(xiàn)狀MSCs和ESCs在脊髓損傷動物模型中療效顯著，臨床治療效果尚在探索。MSCs表達CD73、CD90和CD105，缺乏表達CD14/CD11b、CD79、CD19、CD34、CD45和HLA-DR表面標(biāo)記，具有多分化潛能。體外實驗和動物實驗表明MSCs可以降低谷氨酸興奮毒性、炎細胞因子以及相關(guān)蛋白水平，從而保護神經(jīng)元[9]。抑制嗜中性粒細胞黏附和浸潤，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，增強少突膠質(zhì)細胞和髓鞘的再生。目前MSCs移植已用于臨床實驗，在神經(jīng)、心血管及免疫疾病研究中安全性得到了證實[10]。在頸部脊髓損傷中，移植的MSCs多數(shù)取自于髂骨骨髓。在頸部和胸部脊髓損傷模型中，MSCs的移植治療會改善炎癥、細胞凋亡、瘢痕形成,增加軸突再生、血管生成[11]。臨床胸部脊髓損傷的研究中,自體骨髓經(jīng)靜脈或動脈移植的安全性得到肯定，但運動和感覺功能的改善是否由于移植導(dǎo)致的尚沒有定論。值得注意的是人類臍帶血是豐富的成體干細胞來源，這種干細胞來源也引起中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷和脊髓損傷研究者的關(guān)注。臨床上有研究[12]顯示1例脊髓損傷患者用取自于臍帶血的MSCs在病損處進行移植，最后患者髖部知覺和運動功能得到了改善。

表1 幾種干細胞移植的優(yōu)缺點

ESCs取自于囊胚，且具有發(fā)育全能性和能發(fā)育成三胚層衍生的能力。頸部脊髓損傷模型中，從大腦和脊髓組織取出的整個胚胎脊髓或脊髓神經(jīng)祖細胞作為移植物，移植細胞可存活并分化成神經(jīng)元細胞，使脊髓損傷模型的運動功能得到明顯改善[13]。值得注意的是胸脊髓損傷和肌萎縮性側(cè)索硬化癥模型中此移植方法效果良好；臨床上把來自胚胎組織的神經(jīng)干細胞移植到頸胸部脊髓損傷部位，結(jié)果顯示安全性和有效性顯著[14]。除了移植胚胎組織，部分研究者把ESCs衍生的不同系譜移植入頸脊髓損傷部位。Sharp et al[15]把人ESCs衍生的少突膠質(zhì)祖細胞移植到頸脊髓中線嚴(yán)重挫傷的大鼠模型中。移植使損傷部位縮小、白質(zhì)和灰質(zhì)得到補充、運動神經(jīng)元得到保護，前肢功能得到改善。Sun et al[16]使用人ESCs派生的少突膠質(zhì)祖細胞進行治療，4個月后輻照頸節(jié)段損傷鼠模型，發(fā)現(xiàn)髓鞘脫失減少和前肢運動功能改善。此外移植細胞可以分化成為成熟表達髓磷脂堿性蛋白的少突細胞表型。

1.3MSCs和ESCs移植治療的潛在缺點MSCs可取自成人體細胞，體外培養(yǎng)快且基因穩(wěn)定。它們有獨特的免疫調(diào)節(jié)和生長因子分泌功能。MSCs的增殖分化需要一定的條件控制，目前研究者對其控制還十分困難。臨床允許自體移植，因此可以避免使用免疫抑制劑，但它們不能完全替代脊髓損傷丟失的細胞。MSCs可塑性較ESCs差，有證據(jù)表明移植后MSCs整合到病損部位效果差，機體功能恢復(fù)僅是稍有改善[17]。

ESCs取自于胚泡或胎兒組織受到社會道德約束，因此臨床運用會受到限制。雖然可以用ESCs更多的成熟細胞類型來抑制部分不良的移植后果，但移植未分化細胞群仍會有潛在形成腫瘤的風(fēng)險。有研究[18]表明，細胞分化產(chǎn)生的細胞核型異常和基因擴增會導(dǎo)致腫瘤形成。因此使分化規(guī)范化并創(chuàng)建明確的細胞群有助于減少腫瘤形成的風(fēng)險。

理想的細胞類型應(yīng)該結(jié)合MSCs和ESCs的優(yōu)點而避免缺點。

2 iPSCs療法

2.1iPSCs優(yōu)點及缺點誘導(dǎo)多能干細胞由成人體細胞重編程而形成。后來證明誘導(dǎo)多能干細胞可以用小鼠成纖維細胞(后來使用成人成纖維細胞)誘導(dǎo)得到，其過程用病毒載體將4個轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc)的組合轉(zhuǎn)入分化的體細胞中，但過程仍有許多風(fēng)險，如插入誘變、轉(zhuǎn)基因復(fù)活、不完整切片和克隆變異。

有研究[19]表明iPSCs和ESCs轉(zhuǎn)錄不同是由于特定的啟動子與重組因子關(guān)系和不同的遺傳背景導(dǎo)致。相同之處則在于ESCs和iPSCs在分子和功能上等價，因為它們存在相同的形態(tài)、基因標(biāo)記、表達、線粒體屬性和致瘤性[20]。

從成人體細胞創(chuàng)建多能干細胞規(guī)避了使用ESCs和MSCs的道德障礙，同時細胞可以直接取自患者，從而避免使用免疫抑制劑；此外美國和日本大力推進建立全球捐贈者體細胞iPSC譜，這些體細胞純合子幾個基因位點與患者個體HLA類型匹配，從而使移植無需使用免疫抑制劑；雖然iPSCs有許多優(yōu)點，但目前使用仍存在許多問題，在臨床脊髓損傷患者中，最理想的移植時間是傷后2～4周，但iPSCs形成神經(jīng)系譜卻至少需要4～6個月[21]。目前仍有關(guān)于iPSCs是干細胞的爭論，有研究[22]顯示其保留組織來源的“記憶”，從而影響分化和最后表型。iPSCs技術(shù)正處于起始階段，許多問題亟待解決。

2.2誘導(dǎo)多能干細胞的分化模式目前研究的熱點是iPSCs生成功能神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的規(guī)律以及神經(jīng)元和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)在健康和受損部位的差異。在第一種模式中，人類iPSCs通過外源模式分子向神經(jīng)上皮系分化。有絲分裂原促進形成星形膠質(zhì)祖細胞，此后無功能的星形膠質(zhì)祖細胞通過纖毛神經(jīng)營養(yǎng)因子分化成有功能的星形膠質(zhì)細胞[23]。在第二種模式中，通過表達Sox10、Olig2和zfb536 使小鼠和大鼠成纖維細胞直接重編程為少突膠質(zhì)細胞前體[24]。有研究[25]報道當(dāng)移植誘導(dǎo)多能干細胞進入小鼠大腦創(chuàng)建神經(jīng)元時，神經(jīng)元素2快速過表達并且有效地把誘導(dǎo)多能干細胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元，而這些神經(jīng)元則自發(fā)形成突觸網(wǎng)絡(luò)。另有研究[26]報道成人成纖維細胞通過miR-124，BRN2和MYT1L可以直接被重組成功能性神經(jīng)元并形成突觸。也有其他研究[27]表明iPSCs可以衍生具有谷氨酸能、GABA能和視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞表型。上述研究提供了新的移植治療理論和治療神經(jīng)病理疾病方法。

目前已經(jīng)有動物實驗研究將iPSCs技術(shù)和分化策略使用于體內(nèi)和體外疾病模型。

2.3使用iPSCs技術(shù)治療頸節(jié)段脊髓損傷急性損傷模型與慢性脊髓損傷患者狀況存在差異。Nutt et al[28]使用大鼠建立了早期慢性損傷模型，C4脊髓節(jié)段挫傷4周后，在大鼠損傷脊髓內(nèi)移植iPSCs誘導(dǎo)的神經(jīng)祖細胞和神經(jīng)母細胞。移植8周后，標(biāo)記的NeuN/FOX-3顯示部分移植的細胞分化成成熟的神經(jīng)元，大鼠抓持和負重功能得到改善。

Li et al[29]在脊髓損傷模型中移植了由iPSCs形成的星形膠質(zhì)細胞，并對呼吸功能的變化進行了評估，此研究中大鼠和小鼠都接受了C4脊髓挫傷處理，使動物慢性功能紊亂和膈肌運動神經(jīng)元發(fā)生退化，并且損傷后立即在損傷部位進行移植。損傷移植后2 d、2周和4周分別檢測移植細胞存活和分化成的星形膠質(zhì)細胞(GFAP陽性)，沒有發(fā)現(xiàn)任何致瘤組織且增生低于10%。過度表達GLT1的星形膠質(zhì)細胞移植后，病變面積和總損傷體積減少并保護了膈膜神經(jīng)接點的分布。通過分析自發(fā)EMG活動說明GLT1過度表達的星形膠質(zhì)細胞可以顯著增加背部膈肌肌電圖振幅，表明移植對腹式呼吸功能存在保護作用。

Lu et al[30]在C5節(jié)段半切的大鼠模型中檢測iPSCs生成神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)的移植效果，移植3個月后檢測發(fā)現(xiàn)移植細胞存活并分布在整個損傷區(qū)域，多數(shù)移植細胞表達NeuN(神經(jīng)特定核標(biāo)記)，成熟神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2和Tuj1和成熟星形細胞標(biāo)志物GFAP同時表達，這表明細胞已分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。此研究中也有部分證據(jù)說明移植細胞表達ChAT和Ki67(移植細胞的增殖效應(yīng))，同時也顯示了雖然宿主軸突延伸到病變部位，但行為功能恢復(fù)不明顯。

Kobayashi et al[31]以非人類靈長類動物頸脊髓損傷為模型，對iPSCs形成的神經(jīng)干細胞移植的安全性和有效性進行檢測。成年女性狨猴C5水平受到輕微挫傷，9 d后經(jīng)椎管給猴損傷中心注入iPSCs形成的神經(jīng)元。移植12周后，經(jīng)伊紅染色顯示移植細胞存活并且分化成3個神經(jīng)亞型(NeuN、GFAP、Olig1)；在移植動物身上未發(fā)現(xiàn)任何致瘤性。在移植組和對照組損傷部位周圍有嚴(yán)重的脫髓鞘病變，而在對照組12周后有更高程度的髓鞘脫失。常規(guī)MRI和髓鞘成像發(fā)現(xiàn)移植組存在更多生發(fā)髓鞘，而對照組髓內(nèi)病變處則存在高強度信號區(qū)域。此實驗中發(fā)現(xiàn)兩組血管生成量增加；參與脊髓疼痛機制的降鈣素生成纖維在移植組和對照組沒有差異；移植組中C5水平損傷導(dǎo)致的四肢癱瘓逐漸改善。此外移植后8周兩組間四肢運動功能恢復(fù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

從目前動物頸節(jié)段脊髓損傷模型中發(fā)現(xiàn)iPSCs的治療效果肯定，但缺乏臨床案例，仍需進一步探索。

3 存在的問題與展望

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)逐步發(fā)展使脊髓損傷患者生存率增加，但治療后呼吸和運動功能恢復(fù)較差導(dǎo)致患者生活質(zhì)量沒有明顯提高。目前治療的主要目的是恢復(fù)功能讓患者可以生活自理。細胞移植治療主要通過供體分泌的營養(yǎng)和免疫因子來提高細胞再生能力，替代丟失的神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。MSCs和ESCs移植對脊髓損傷修復(fù)療效肯定，但是這些細胞由于各種原因?qū)е码y以應(yīng)用于商業(yè)和臨床。MSCs修復(fù)能力有限，ESCs受道德約束且攜帶核型異常有致瘤風(fēng)險，而iPSCs克服了以上細胞的缺點，但誘導(dǎo)方法也有其缺點，如效率低下、難以實施于臨床、可能保留一個表觀遺傳記憶。此外iPSCs主要形成的是神經(jīng)祖細胞，這類細胞有良好生存能力，但它們移植時通常是混合群，一旦移植，分化和表型都超出了實驗者的控制，因此這限制了該細胞移植的臨床實施。iPSCs技術(shù)包括了疾病建模、再生醫(yī)學(xué)、發(fā)展生物學(xué)的觀點。目前研究模型主要是大鼠，僅1例以非人類靈長動物為模型。研究均表明移植細胞可存活、能分化為成熟神經(jīng)元、減少損傷面積和體積、增加血管生成、無致瘤性等特點。由于iPSCs技術(shù)在頸脊髓損傷應(yīng)用的案例較少，所以很難預(yù)測哪些因素能提高移植療效。在評價功能恢復(fù)時，選擇合適的動物模型、移植時機、移植細胞類型并使用行為評估十分重要。隨著研究者對iPSCs認識及在移植調(diào)控方面研究的不斷深入，iPSCs在脊髓損傷修復(fù)中的應(yīng)用前景將十分廣闊。

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