AQP8在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

趙金錢(qián)，陳 炯，方恒忠，楊旭東，朱興興，胡丕波

胰腺導(dǎo)管腺癌是最常見(jiàn)病理類(lèi)型的胰腺癌，占胰腺癌患者的85%以上。胰腺癌具有發(fā)病癥狀隱蔽、早期病灶易出現(xiàn)周?chē)M織浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移、惡性程度極高、放化療不敏感等重要的臨床及生物學(xué)特點(diǎn)，到目前為止，根治性腫瘤切除手術(shù)治療是胰腺癌患者長(zhǎng)期存活唯一有效可行的方法，但是此病患者臨床確診時(shí)多數(shù)已處于中晚期階段，喪失根治腫瘤手術(shù)時(shí)機(jī)，故該病根治性手術(shù)切除率較低、預(yù)后極差。而現(xiàn)有的最為廣泛使用的胰腺癌早期篩查腫瘤標(biāo)志物糖抗原CA19-9(Carbohydrate atigen 19-9, CA19-9)在胰腺癌早期階段常處于正常水平，它并非是胰腺癌特異性腫瘤標(biāo)志物，在肝膽胰其他類(lèi)疾病中也可能升高，且胰腺癌中3%～7%的患者為L(zhǎng)ewis抗原陰性血型結(jié)構(gòu)，不表達(dá)CA19-9，因此在診斷胰腺癌方面，其敏感性和特異性并非理想，早期診斷價(jià)值有限，多用于監(jiān)測(cè)胰腺癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或療效評(píng)估。至今為止，該病的早期診斷仍缺乏特異性及敏感性均較高的腫瘤標(biāo)志物，尋找胰腺癌潛在的腫瘤標(biāo)志物尤為關(guān)鍵。水通道蛋白家族(aquaporins, AQPs)是一組選擇性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的膜蛋白，即AQP0-AQP12，AQPs直接參與人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[1-3]，水通道蛋白8(aquaporins8, AQP 8)是AQPs成員之一，但其表達(dá)與胰腺癌的臨床資料關(guān)系國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，本課題組從AQP8的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)水平研究其在胰腺癌組織中的表達(dá)，探究其與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床病理資料的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普外科收治行根治性手術(shù)切除，并經(jīng)病理證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌患者的石蠟包埋的胰腺導(dǎo)管腺癌癌組織(pancreatic duct adenocarcinoma tissue, PC)及其相配對(duì)的癌旁正常胰腺組織(non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma, Non-PC)(距腫瘤組織邊緣>2 cm)各87 例(2010年1月～2013年12月)以及連續(xù)10例根治性手術(shù)切除患者的配對(duì)新鮮PC、Non-PC(2016年8月～12月)，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。被研究者臨床資料完整，術(shù)前均無(wú)放化療。 87 例患者中：男51例，女36例；年齡41～85(63.36±11.48)歲，< 60歲25例，≥60歲62例；胰頭部癌63例，胰體尾部癌24例；高分化18例，中低分化69例；直徑<2 cm者23例，≥2 cm的64例；TNM分期Ⅰ期40例，Ⅱ期47例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，未轉(zhuǎn)移40例；神經(jīng)侵犯38例，未被侵犯49例。本研究得到患者的知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2主要試劑TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司)；AQP8一抗(英國(guó)Abcam公司)；二抗、免疫組化(immunohistochemistry，IHC)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1qRT-PCR 分別取PC及Non-PC各50 mg，提取總RNA并作為模板反轉(zhuǎn)錄生成cDNA進(jìn)行qRT-PCR。以GAPDH作為內(nèi)參照，F(xiàn)：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，R：5′-CAGGA AGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′，產(chǎn)物大小180 bp；AQP8引物序列，F(xiàn)：5′-GCCTGCTTGTTGGACTGCTC-3′，R：5′-GGAATCCCACGAGCTCTGCT-3′，產(chǎn)物大小94 bp。

1.3.2Western blot 分別將PC及Non-PC充分裂解測(cè)總蛋白濃度。上樣量各為 50 μl，經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入稀釋一抗(1 ∶1 000)，孵育洗滌后加入稀釋二抗(1 ∶5 000)，顯色、定影后觀察。

1.3.3IHC 石蠟包埋標(biāo)本3 μm連續(xù)切片，脫蠟、抗原修復(fù)后滴加3% H2O2；滴加一抗稀釋液(1 ∶200)，4 ℃過(guò)夜，復(fù)溫后加入二抗，最后顯色、封片。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)采用半定量評(píng)分法[4](即低倍鏡視野下陽(yáng)性著色細(xì)胞百分比及著色程度來(lái)進(jìn)行評(píng)分)，如下方式分別記分：視野中無(wú)染色細(xì)胞及染色細(xì)胞占視野細(xì)胞的1%～10%、11%～50%、>50%分別記為0～3分；切片基本未著色、淡黃色、黃色、棕黃色分別計(jì)0～3分，每張切片有兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師共同評(píng)分，2項(xiàng)得分乘積≥4即定為陽(yáng)性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1PC、Non-PC中AQP8的mRNA表達(dá)采用qRT-PCR方法分別檢測(cè)配對(duì)的PC及Non-PC各10例，平均表達(dá)水平分別為(16.276±9.190)、(5.847±3.757)，AQP8 mRNA 的平均表達(dá)量范圍分別為 (7.57～32.79)、(1.24～12.00)。PC組 AQP8 mRNA 的表達(dá)水平明顯高于Non-PC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.570，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.2PC、Non-PC中AQP8的表達(dá)

2.2.1Western blot檢測(cè)AQP8的表達(dá)情況 分別檢測(cè)PC及Non-PC各10 例，有8例(80%)PC組AQP8的表達(dá)明顯高于Non-PC組，Non-PC組表達(dá)水

圖1 兩組中AQP8 mRNA表達(dá)水平比較與Non-PC組比較：**P<0.01

平均較低，PC組AQP8平均灰度值為(1.04±0.31)，顯著高于Non-PC組(0.31±0.13)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.426，P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組中AQP8的表達(dá)水平A：PC組；B：Non-PC組

2.2.2IHC檢測(cè)AQP8的表達(dá) 檢測(cè)87例PC及相配對(duì)的Non-PC，結(jié)果顯示AQP8主要表達(dá)于PC導(dǎo)管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，PC組AQP8陽(yáng)性表達(dá)的有69例(79.31%)，高于Non-PC組(18.39%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=64.609，P<0.001)。見(jiàn)圖3。

圖3 AQP8在兩組中的表達(dá) × 400A：PC組；B：Non-PC組

2.3AQP8與胰腺導(dǎo)管腺癌患者臨床病理資料間的關(guān)系IHC顯示，AQP8的表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌的瘤體直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有顯著相關(guān)性(P<0.001)。而與患者其他臨床資料之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 AQP8表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

3 討論

AQP8是由261個(gè)氨基酸編碼的水通道細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，AQP8在維持細(xì)胞和組織器官水電解質(zhì)平衡方面起重要作用。而AQP8在胰腺導(dǎo)管腺癌的細(xì)胞定位與病理生理功能仍鮮為人知，本研究通過(guò)IHC檢測(cè)87例PC與Non-PC中AQP8的表達(dá)，結(jié)果表明AQP8在PC中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，Non-PC導(dǎo)管細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，Non-PC腺泡及胰島細(xì)胞團(tuán)中弱表達(dá)，AQP8主要表達(dá)于PC導(dǎo)管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且本研究顯示AQP8的表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌的瘤體直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有顯著相關(guān)性，而與患者其他臨床資料之間無(wú)顯著相關(guān)性。雖然AQP8在Non-PC腺泡細(xì)胞及胰島細(xì)胞團(tuán)有一定表達(dá)，但進(jìn)一步Western blot及qRT-PCR表明該蛋白質(zhì)及其mRNA在PC中顯著高表達(dá)，而Non-PC呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。這提示AQP8在PC中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)可能與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)病原因存在一定的相關(guān)性，AQP8的檢測(cè)有助于評(píng)估胰腺導(dǎo)管腺癌的臨床病情，是新的胰腺導(dǎo)管腺癌早期診斷蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物。

AQP8與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切。Zhu et al[5]利用免疫組化等方法研究了AQP8在腦星形細(xì)胞瘤中表達(dá)情況，結(jié)果表明AQP8主要表達(dá)于腦星形細(xì)胞瘤的細(xì)胞質(zhì)中，在高級(jí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤特別是惡性膠質(zhì)瘤中顯著高表達(dá)，這提示AQP8在星形細(xì)胞瘤的分化方面起重要作用，可能是星形細(xì)胞瘤的一個(gè)生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。Chang et al[6]研究了細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶1/2(Erk1/2)及AQP8在宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示在上述兩種組織中Erk1/2及AQP8均較正常宮頸組織顯著高表達(dá)，而Erk1/2及AQP8的高表達(dá)在宮頸上皮內(nèi)瘤變轉(zhuǎn)變成宮頸癌的過(guò)程中起著重要作用，且AQP8的高表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞浸潤(rùn)深度存在相關(guān)性，AQP8有可能成為宮頸癌早期診斷潛在的分子標(biāo)志物。而進(jìn)一步的以慢病毒為載體通過(guò)基因轉(zhuǎn)染方法提高宮頸癌Siha細(xì)胞AQP8基因的表達(dá)，能增加癌細(xì)胞侵襲和局部浸潤(rùn)的能力，進(jìn)一步揭示了AQP8在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用[7]。

AQP8能調(diào)整細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)線粒體的滲透壓及體積變化，Marchissio et al[8]研究發(fā)現(xiàn)肝癌 HepG2 細(xì)胞系線粒體AQP8能促進(jìn)線粒體中H2O2的釋放，而敲除肝癌細(xì)胞線粒體AQP8基因，導(dǎo)致線粒體內(nèi)H2O2堆積及線粒體功能失調(diào)，線粒體及肝癌細(xì)胞失去了生存能力，進(jìn)而引起肝癌細(xì)胞壞死而非正常凋亡，這個(gè)發(fā)現(xiàn)可能對(duì)于肝癌細(xì)胞的化療提供新的思路。而AQP8在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中顯著高表達(dá)，也可通過(guò)類(lèi)似調(diào)控AQP8的基因表達(dá)進(jìn)一步探索胰腺導(dǎo)管腺癌治療新策略，因此AQP8有可能成為潛在的胰腺導(dǎo)管腺癌生物治療靶點(diǎn)。這些文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明AQP8在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，有可能成為新的腫瘤診斷與治療的標(biāo)志物。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。最新的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究[3]表明在發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中AQP8高表達(dá)，并且AQP8可以促使EMT的發(fā)生，上皮類(lèi)腫瘤細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步過(guò)表達(dá)AQP8細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞穿膜數(shù)顯著高于對(duì)照組(88.0±7.2vs51.6±4.0)，這項(xiàng)研究[3]結(jié)果提示AQP8可能是通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生，從而加速腫瘤細(xì)胞向周?chē)M織擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

而Wang et al[9]利用IHC方法研究AQP8在結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明AQP8主要表達(dá)于癌旁正常組織，癌組織無(wú)明顯表達(dá)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本文AQP8在PC中高表達(dá)而在Non-PC中弱表達(dá)截然相反。

綜上所述，PC中高表達(dá)的AQP8與瘤體直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)，這揭示了AQP8與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系緊密，其病理切片IHC檢測(cè)有助于本病患者病情評(píng)估，可能是篩查早期胰腺導(dǎo)管腺癌的蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物，但其在胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制目前尚未清楚，可能與AQP8能促進(jìn)EMT的發(fā)生有關(guān)。后期課題組將會(huì)使用細(xì)胞轉(zhuǎn)染及基因敲除技術(shù)，進(jìn)一步探究并闡述AQP8在胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

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