柿餅污染霉菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

張倩 白冬紅 張晶 陳義倫 辛力

摘要：為控制柿餅霉變，以發(fā)霉的小萼子柿餅為原料，對(duì)其中霉菌進(jìn)行分離純化，并對(duì)主要霉菌進(jìn)行鑒定和生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明，從發(fā)霉柿餅中分離得到兩株優(yōu)勢(shì)菌S1和S2，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，S1為產(chǎn)黃青霉，S2為黑曲霉；菌株S1產(chǎn)黃青霉的最適生長(zhǎng)條件為：溫度25℃，濕度大于70%，pH 5～7，熱致死溫度和時(shí)間為65℃、5 min或70℃、1 min；菌株S2黑曲霉的最適生長(zhǎng)條件為：溫度30℃，濕度大于70%，pH 5，熱致死溫度和時(shí)間為65℃、15 min或70℃、1 min。

關(guān)鍵詞：柿餅；霉菌；分離與鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：S665.209文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）02-0076-07

Abstract Using the moldy dried persimmon of Small Calyx as experimental materials， the main mold strains were isolated and identified by morphological and molecular biological methods， and their biological characteristics were also studied. Two dominant strains， named S1 and S2 were isolated and identified as Penicillium chrysogenum and Aspergillus niger respectively by morphological and molecular biological methods. The optimal growth conditions for S1 strain were temperature as 25℃， humidity as more than 70%， pH value as 5.0～7.0，thermal death point and time as 65℃ and 5 minutes or 70℃and 1 minute. The optimal growth conditions for S2 strain were temperature as 30℃， humidity as more than 70%， pH value as 5.0， thermal death point and time as 65℃ and 15 minutes or 70℃ and 1 minutes.

Keywords Dried persimmon； Mold； Isolation and identification； Biological characteristics

柿（Diospyros kaki） 原產(chǎn)于我國(guó)，是我國(guó)重要的特色水果之一。我國(guó)柿品種繁多，據(jù)全國(guó)柿資源調(diào)查統(tǒng)計(jì)，有1 058種，其中大多數(shù)是我國(guó)特有品種[1]。柿餅由于加工制作簡(jiǎn)單、耐貯藏運(yùn)輸而成為柿子加工的主產(chǎn)品。柿餅富含果糖、葡萄糖、天然有機(jī)酸、錳、鈣、維生素等，是養(yǎng)生食品中的佳品[2]，且頗具醫(yī)療保健作用[3]。柿餅中還含有較多的天然抗氧化物，可以防止一些疾病的發(fā)生[4，5]。

柿子資源豐富，且采收期短，所以將不宜鮮食的柿子加工成柿餅是一個(gè)很好的選擇。傳統(tǒng)的柿餅加工多采用自然干制法，該法基本靠露天曬和風(fēng)吹，需要長(zhǎng)達(dá)數(shù)月的時(shí)間來(lái)完成干燥，且多由各家各戶分散加工，生產(chǎn)條件粗放，生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化、機(jī)械化和規(guī)?；潭染^低，加上柿子糖含量偏高，柿餅很容易受到微生物主要是霉菌的污染[6]，產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量較差[7]。

在我國(guó)，含水量較高的柿餅（30%～40%）一般采用冷凍或冷藏保存，柿餅進(jìn)入零售市場(chǎng)（超市）后，往往所處環(huán)境為常溫，散裝柿餅會(huì)很快失水干縮變硬，口感品質(zhì)劣變，嚴(yán)重影響銷售；密封保濕包裝，則隨著柿餅中二氧化硫的散失，柿上會(huì)有霉菌生長(zhǎng)，存在衛(wèi)生安全問(wèn)題。而且在常溫下柿餅7天左右就開(kāi)始霉變，嚴(yán)重影響柿餅品質(zhì)以及在國(guó)際市場(chǎng)中的競(jìng)爭(zhēng)力?；诖?，本研究在霉變柿餅上分離純化霉菌，對(duì)主要霉菌采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，對(duì)主要霉菌的菌學(xué)特性進(jìn)行研究，可為有效控制柿餅霉變和延長(zhǎng)貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

小萼子柿柿餅，濰坊臨朐神力有限公司提供。選擇當(dāng)年自然干燥的小萼子柿餅，發(fā)霉后放入無(wú)菌樣品袋中，編號(hào)備用。其水分含量為41.67%，水分活度為0.876，可溶性糖含量為43.61%，總酸含量為1.17 g/kg，含硫量18.4 mg/kg；霉菌總數(shù)為35 cfu/g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 霉菌的分離、純化與保存 ①菌種分離：在超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌刀片切取柿餅的發(fā)霉部分，切碎，加入90 mL無(wú)菌水進(jìn)行懸??；28℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)30 min，取懸浮液制成稀釋倍數(shù)為101、102、103、104、105、106的稀釋液；取稀釋液1 mL加入滅菌培養(yǎng)皿中，倒入冷卻至50℃左右的孟加拉紅培養(yǎng)基，搖勻，25℃恒溫培養(yǎng)5～7 d[8]。

②菌種純化：采用平板劃線分離法，用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取含菌樣品在固體培養(yǎng)基表面作有規(guī)則劃線，菌株經(jīng)過(guò)多次從點(diǎn)到線的稀釋，最后經(jīng)培養(yǎng)得到純種單菌落[9]。

③菌種保藏：將純菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長(zhǎng)滿斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 霉菌菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 ①點(diǎn)植培養(yǎng)法[14]：從純化菌種平板上挑取單個(gè)孢子或菌落，點(diǎn)植于PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基（CA）和察氏酵母膏培養(yǎng)基（CJA）上等邊三角形三個(gè)頂點(diǎn)或中心處，倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天觀察其生長(zhǎng)形態(tài)。

②顯微鏡直接觀察法：在載玻片上滴加一滴乳酸苯酚溶液，用接種針挑取菌落，平攤于玻片上，加蓋蓋玻片鏡檢。

1.2.3 霉菌菌株的分子生物學(xué)鑒定 ①DNA提取：將所得優(yōu)勢(shì)菌株在PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫倒置培養(yǎng)7 d后，通過(guò)真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA。

②PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增使用的上游引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），下游引物為ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：50 μL，其中10×buffer 5 μL；Mg2+4 μL；dNTP 4 μL；引物各2 μL；Taq酶2 μL；模板4 μL；雙蒸水補(bǔ)足到50 μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10 min。4℃保存[10，11]。

測(cè)序分析：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序的拼接結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[12]。

1.2.4 主要污染霉菌的生物學(xué)特性研究 ① 溫度對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響：將培養(yǎng)7 d左右的霉菌S1、S2利用8 mm打孔器打成菌餅[13]，放置于PDA培養(yǎng)基中央，分別在4、20、25、30、35、40℃下培養(yǎng)5～7 d，測(cè)定其凈生長(zhǎng)直徑。

凈生長(zhǎng)直徑（cm）=菌落直徑-0.8

②濕度對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響：將培養(yǎng)7 d左右的霉菌S1、S2利用8 mm打孔器打成菌餅，放置于PDA培養(yǎng)基中央，置于環(huán)境濕度為50%、60%、70%、80%、90%下，28℃培養(yǎng)5～7 d，觀察生長(zhǎng)情況，并測(cè)定其凈生長(zhǎng)直徑。

③pH值對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響：將培養(yǎng)7 d左右的霉菌S1、S2利用8 mm打孔器打成菌餅，移到pH值分別為3、5、7、9、11的培養(yǎng)基上，置于28℃下恒溫培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，并測(cè)定其凈生長(zhǎng)直徑。

④霉菌致死溫度和時(shí)間測(cè)定：將在PDA斜面上培養(yǎng)7d的霉菌制成濃度為106個(gè)/mL的孢子懸浮液，取1 mL放入1.5 mL滅菌離心管中，分別置于50、55、60、65、70℃恒溫水浴鍋中處理1、5、10、15、20、25 min后迅速冷卻，之后用吸管取0.1 mL培養(yǎng)液到培養(yǎng)基上，涂平板，28℃下倒置培養(yǎng)，觀察霉菌菌落生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 柿餅污染霉菌的分離

經(jīng)分離純化，得到7株霉菌。選取其中2株優(yōu)勢(shì)菌株S1和S2進(jìn)行以下試驗(yàn)。

2.2 主要霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定

S1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌落形態(tài)如圖1a、b所示，可見(jiàn)，S1菌落顏色為淡藍(lán)綠色，菌落表面有密集的淡黃色液滴，背面為淺黃色；在顯微鏡下觀察的菌株形態(tài)如圖1c所示，可見(jiàn)，孢子囊呈掃帚狀。

S2在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖2a、b所示，可見(jiàn)，菌落初期為白色，5～7 d后為灰黑色，長(zhǎng)而厚，呈棉絮狀；在顯微鏡下觀察的菌株形態(tài)如圖2c所示，可見(jiàn)，分生孢子為球形，呈黑褐色。

結(jié)合S1和S2在CA培養(yǎng)基和CJA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d形態(tài)觀察以及在顯微鏡下的菌絲形態(tài)觀察，初步判定S1為青霉屬，S2為曲霉屬。

2.3 主要霉菌的分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增 由圖3可知，S1和S2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列長(zhǎng)度均在750 bp左右。

2.3.2 測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在DNAMAN上進(jìn)行拼接，并將該序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，挑選同源性高的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖5和圖6），可知，菌株S1與產(chǎn)黃青霉的同源性較高，S2與黑曲霉的同源性較高，結(jié)合形態(tài)鑒定和生理生化鑒定結(jié)果，最終鑒定霉菌S1為產(chǎn)黃青霉，霉菌S2為黑曲霉。

2.4 主要霉菌的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響 如圖7所示，霉菌S1產(chǎn)黃青霉和霉菌S2黑曲霉均能在較大的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，且S1在25℃下長(zhǎng)勢(shì)最好，S2在30℃下長(zhǎng)勢(shì)最好，因此霉菌適宜生長(zhǎng)的溫度為25～30℃，且在4℃下幾乎不生長(zhǎng)。因此柿餅在冷藏條件下儲(chǔ)藏，可以有效防止霉變；而常溫（20～30℃）則是霉菌滋生的敏感溫度。

2.4.2 濕度對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響 如圖8所示，霉菌S1產(chǎn)黃青霉和霉菌S2黑曲霉均在濕度大于60%時(shí)開(kāi)始生長(zhǎng)，并且隨著濕度增加，霉菌S1和S2的生長(zhǎng)速度均顯著增加，因此在柿餅貯藏的過(guò)程中要保持通風(fēng)干燥，使柿餅處于相對(duì)濕度較低環(huán)境中（60%以下），將有利于防止霉菌的生長(zhǎng)繁殖。

2.4.3 pH值對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響 霉菌對(duì)酸堿度不太敏感，一般在pH值3～9都能生長(zhǎng)。由圖9可知，霉菌S1產(chǎn)黃青霉適宜生長(zhǎng)的pH值范圍是5～7，霉菌S2黑曲霉的最適生長(zhǎng)pH值為5，這兩菌株均適宜在酸性條件下生長(zhǎng)。

2.4.4 霉菌的熱致死溫度和時(shí)間測(cè)定 兩種霉菌的耐熱性結(jié)果如圖10和圖11所示，霉菌S1產(chǎn)黃青霉和S2黑曲霉在55℃以上均能被致死，并且隨著溫度和時(shí)間的增加，致死率顯著增加。霉菌S1產(chǎn)黃青霉在65℃、5 min或70℃、1 min時(shí)致死率均能達(dá)到100%，霉菌S2黑曲霉在65℃、15 min或70℃、1 min時(shí)致死率均達(dá)到100%，黑曲霉的耐熱性更強(qiáng)，因此可以使用熱燙的方法在短時(shí)間內(nèi)殺死霉菌。

3 討論與結(jié)論

3.1 污染霉菌的分離鑒定

霉菌是導(dǎo)致柿餅成品霉變腐爛的主要原因，大大降低柿餅品質(zhì)及食用價(jià)值，越來(lái)越多地引起柿餅加工企業(yè)的關(guān)注。本研究對(duì)柿餅進(jìn)行霉菌的分離鑒定，最終確認(rèn)柿餅的主要霉變菌，并研究其菌學(xué)特性，有利于控制霉變，從而達(dá)到延長(zhǎng)柿餅保質(zhì)期的目的。

由于真菌種類繁多、分布廣泛、形態(tài)特征復(fù)雜，準(zhǔn)確鑒定真菌病原菌是一項(xiàng)復(fù)雜而艱巨的工作。此外，由于真菌的形態(tài)特征與生理生化指標(biāo)易隨環(huán)境條件的變化而表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，因此傳統(tǒng)的真菌分類和鑒定方法不能準(zhǔn)確鑒定到種的水平。鑒于傳統(tǒng)的病原真菌分類和鑒定的局限性，采用擴(kuò)增真菌rDNA-ITS 進(jìn)行真菌菌株的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究，已成為植物病原學(xué)的研究熱點(diǎn)[15]。崔雨琪等從土壤中分離得到一株產(chǎn)酸能力較高的真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)及ITS rDNA基因序列分析鑒定為黑曲霉[16]。田峰等將一株來(lái)源于浙貝母新鮮鱗莖的內(nèi)生真菌菌株FTJZZJ09經(jīng)ITS rDNA基因序列鑒定為產(chǎn)黃青霉[17]。Luo等對(duì)深海中得到的菌株DY-F2利用ITS鑒定，確定為產(chǎn)黃青霉[18]。本研究從發(fā)霉柿餅中分離得到兩株主要霉菌污染菌S1和S2，通過(guò)形態(tài)觀察及ITS rDNA序列對(duì)比并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，最終確定為產(chǎn)黃青霉和黑曲霉，這與王春紅[14]和張曉旭[19]等的研究一致，驗(yàn)證了前人結(jié)論。

3.2 污染霉菌的生物學(xué)特性研究

真菌的生長(zhǎng)繁殖需要一定條件，主要有營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)、溫度、濕度、酸堿環(huán)境、呼吸環(huán)境等，因此，研究分離菌的生長(zhǎng)特性，可為控制其生長(zhǎng)提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，分離出的兩株霉菌在4℃下不生長(zhǎng)，所以建議柿餅的貯運(yùn)和超市銷售溫度條件為0～4℃；兩株霉菌在濕度60%以下幾乎不生長(zhǎng)，因此在柿餅的包裝和銷售過(guò)程中要保持一個(gè)干燥的環(huán)境；產(chǎn)黃青霉和黑曲霉的熱致死溫度較低，因此可以在包裝前熱處理殺滅柿餅表面霉菌，但是短時(shí)間加熱是否會(huì)使其返澀，還有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Bi Y， Ge Y H， Wang C L. Melon production in China[J]. Acta Horticulturate，2007，731（1）：493-500.

[2] 高清山. 柿子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其利用[J]. 山西果樹(shù)， 2015（1）： 10-12.

[3] Giordani E， Doumett S. Selected primary and secondary metabolites in fresh persimmon： a review of analytical methods and current knowledge of fruit composition and health benefits[J]. Food Research International，2011， 44（7）： 1752-1767.

[4] Matsumura Y， Ito T. Antioxidant potential in non-extractable fractions of dried persimmon（Diospyros kaki Thunb.）[J]. Food Chemistry，2016， 202： 99-103.

[5] Matsumura Y， Ito T， Kayano S.Data in support of antioxidant activities of the non-extractable fraction of dried persimmon （Diospyros kaki Thunb.）[J]. Data in Brief， 2016，8： 1247-1254.

[6] 劉滔， 朱維， 李春美. 我國(guó)柿子加工產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與對(duì)策[J]. 食品工業(yè)科技， 2016（24）：369-375.

[7] 陳合， 彭丹， 王磊， 等. 柿餅保質(zhì)期控制技術(shù)研究（Ⅰ）[J].食品科技， 2009， 34（11）： 66-68.

[8] 劉旭川， 王勇， 羅成. Viili 中霉菌的分離純化與鑒定[J].食品科學(xué)，2010，31（3）：207-208.

[9] 郝林， 王森云， 鄭惠山. 影響柿餅保藏因素的研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2000， 20（1）： 30-32.

[10]顧雙， 陳俊霖， 王向陽(yáng). 傳統(tǒng)霉菌發(fā)酵食品中的霉菌DNA擴(kuò)增[J]. 食品科學(xué)， 2017， 38 （4）： 83-86.

[11]Wang P， Liu Y， Yin YG， et al. Diversity of microorganisms isolated from the soil sample surround Chroogomphus rutilus in the Beijing region[J]. International of Biological Sciences，2011，7（2）：209-220.

[12]勞超， 劉云龍， 謝勇， 等.首次報(bào)道由異絲腐霉引起的煙草根腐病[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 27（6）： 905-909.

[13]范昆， 張雪丹， 余賢美，等. 無(wú)花果炭疽病菌的生物學(xué)特性及8種殺菌劑對(duì)其抑制作用[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2013， 43（1）： 75-81.

[14]王春紅， 孟泉科， 張寶善. 柿餅霉變微生物的鑒定及防霉措施研究[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2010， 38（2）： 99-103.

[15]劉盼紅. 貯藏蘋(píng)果中展青霉素產(chǎn)生菌的分離鑒定和生長(zhǎng)代謝特征研究[D].楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2008.

[16]崔雨琪， 方迪， 周立祥. 一株黑曲霉的分離鑒定及其對(duì)土壤重金屬的生物浸出效果[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2014，20（3）：420-425.

[17]田峰， 何仁發(fā)， 李明月， 等. 浙貝母內(nèi)生真菌菌株FTJZZJ09及其抑菌活性成分[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2010， 37（10）： 1475-1480.

[18]Luo J J， Ding J F， Li G W. Characterization of a formaldehyde degrading fungus Penicillium chrysogenum DY-F2 isolated from deep sea sediment[J]. International Bio-deterioration & Biodegradation 2014， 89： 45-49.

[19]張曉旭， 葛武鵬， 張國(guó)富. 富平柿餅中霉菌的分離鑒定及防控技術(shù)研究[J]. 食品工業(yè)，2016， 37（8）： 149-151.