let-7b介導IGF2BP3表達抑制雞成肌細胞增殖效果的研究

岳孝亭，劉 燊，楊承忠，呂敏芝，郭金彪，張綺瓊，劉潔珠，林樹茂

(佛山科學技術學院 生命科學與工程學院，廣東 佛山528231)

骨骼肌的生長發(fā)育過程涉及多信號途徑、多基因表達及網(wǎng)絡式調(diào)控，其過程很復雜。包括骨骼肌的細胞增殖、分化和凋亡等過程，受到多種細胞因子的調(diào)控。在不同的發(fā)育階段，相關基因互相影響，借助于復雜的網(wǎng)絡調(diào)控通路方式，共同維持肌肉的生長與分化。目前對骨骼肌發(fā)育的研究主要集中在蛋白編碼基因，其中包含MADS同源盒蛋白、鋅指蛋白和Wnt家族成員、基于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)蛋白質(zhì)家族的Myf5、MyoD、Mrf4和Myogenin等生肌調(diào)節(jié)因子(Myogenic Regulatory Factors，MRFs)或肌源性分化因子(Myogenic Differentiation Factors，MDFs)等基因，這些基因的表達對肌細胞的構(gòu)成、分化和肌組織形態(tài)的構(gòu)建起著特殊的作用[1-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為22 nt(18～25 nt)的非編碼單鏈小分子RNA，在動物體內(nèi)普遍存在并且參與其生長、發(fā)育、代謝、凋亡等生命過程。miRNA通過與靶基因mRNA的3'UTR相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平引起靶基因mRNA的降解或抑制其蛋白質(zhì)合成，從而來調(diào)控靶基因的表達[4]。

從19世紀末，Lee等[5]在秀麗新小桿線蟲(c.elegans)中發(fā)現(xiàn)了一種調(diào)控胚胎后期發(fā)育的第一個miRNA-lin4后，有越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)。本世紀初，有人在線蟲中初次發(fā)現(xiàn) let-7，現(xiàn)已成為目前研究最為普遍的miRNA家族之一[6]。let-7具有高度時空表達性、組織特異性、保守性等特點，普遍參加細胞的分化、增殖、凋亡和癌細胞的浸潤。先期研究發(fā)現(xiàn)，let-7b作為let-7家族的重要成員之一，對雞的骨骼肌生長發(fā)育發(fā)揮重要作用[7]。通過采用生物信息學方法進行分析，進一步發(fā)現(xiàn)IGF2BP3是let-7b的候選靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BP3(Insulin-like Growth Factor 2 mRNA-Binding Protein 3)，又名IMP3(IGF2 mRNA-Binding Protein 3)、KOC(KH-domain containing Protein overexpressed in cancer)和L523S，屬于VICKZ家族(Vgl，RBP/Vera，IMP-l，2，3，CRD-BP，KOC，ZBP-l)，是胰島素樣生長因子RNA結(jié)合蛋白家族(RNA-binding proteins，RBPs)中的重要成員，具有促進生長發(fā)育的作用。研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BP3(IMP3)能夠高度特異地與編碼IGF2的mRNA相結(jié)合，是一種可以與胰島素樣生長因子(IGFs)相結(jié)合的分泌性蛋白，參與IGF2 mRNA的定位、穩(wěn)定性、反轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)，對RNA的運輸、穩(wěn)定、細胞的增殖和遷移具有非常重要的作用[8]。為此，本研究以let-7b過表達載體轉(zhuǎn)染雞成肌細胞，通過觀察成肌細胞的生長以及IGF2BP3等相關基因的表達情況，以進一步探討let-7b對雞骨骼肌生長發(fā)育的分子調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建

根據(jù)let-7b 前體序列設計引物(見表1)，在其兩端各保留約200 bp，從雞基因組中PCR 擴增獲得約541bp片段，通過酶切位點NotI與ApaI將其連入真核表達載體pcDNA3.1，構(gòu)建let-7b過表達載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b。根據(jù)預測的IGF2BP3 3′UTR 與let-7b結(jié)合的靶位點設計引物，在其兩端各保留約200bp，從雞基因組中PCR 擴增獲得約453bp片段，通過酶切位點SacI與XbaI將其連入靶基因報告載體pMIR-REPORT，構(gòu)建IGF2BP3報告載體pmirGLO-let-7b-IGF2BP3 3'UTR。根據(jù)種子區(qū)設計突變引物，與IGF2BP3 3′UTR 引物進行重疊PCR對靶位點進行突變，將突變產(chǎn)物連入pMIR-REPORT，構(gòu)建IGF2BP3靶位點突變報告載體pMIR-mIGF2BP3(表2)。

1.2 雙熒光素酶檢測

本試驗采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行靶標驗證。首先將let-7b的候選靶基因IGF2BP3 3'UTR靶序列插入到螢火蟲熒光素酶基因下游。然后進行共轉(zhuǎn)染試驗。試驗分為3個組：(1)let-7b過表達載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b與其靶基因IGF2BP3 驗證載體pmirGLO-let-7b-IGF2BP3 3'UTR共轉(zhuǎn)染到DF-1細胞(let-7b組)；(2)let-7b過表達載體與靶基因IGF2BP3種子序列點突變載體共轉(zhuǎn)染組(let-7b-mut組)；(3)let-7b過表達載體與空質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染對照組(NC組)。

具體方法為：在24孔板中，對于每孔細胞，轉(zhuǎn)染pmirGLO-miR-基因3'UTR(或突變質(zhì)粒)200 ng、pcDNA-EGFP-pre-miRNA 600 ng及陰性對照30 pM。50 μL OPTI-MEMI培養(yǎng)基稀釋2 μL Lipofectamine 2000試劑后孵育5 min；混合需轉(zhuǎn)染的DNA和稀釋的Lipofectamine 2000，室溫孵育20 min后直接將復合物加到含0.4 mL OPTI-MEMI培養(yǎng)基的細胞中，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻；在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后換0.5 mL含10%FBS，不含抗生素的正常DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，收集細胞。

表1 pre-let-7b及其側(cè)翼序列的擴增引物Table 1 Primer for pre-let-7b

注：下劃線部分為保護堿基序列，斜體部分為酶切位點(NotI與ApaI)。下同。

Note：The underlined part is protective base，the italicized part is restriction site. (NotIandApaI).The same below.

表2 let-7b靶基因IGF2BP3 3'UTR序列擴增引物Table 2 Primer for predicted target gene IGF2BP3 3'UTR of let-7b

熒光素酶檢測按照Dual Luciferase Reporter Gene AssayKit(Promega公司)說明書檢測報告基因的強度。

1.3 成肌細胞的分離培養(yǎng)

參照成肌細胞分離培養(yǎng)的步驟進行[9]。將孵化至E11 的胚蛋，用75%乙醇消毒蛋殼，無菌操作取出胚胎，分離肌肉置于預先加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)的培養(yǎng)皿中。將肌肉組織剪碎，加入DMEM生長培養(yǎng)基(含15%胎牛血清)；將組織液移入50 mL離心管中，在旋渦振蕩器上高速混合40 s，吸取上清液，用雙層200 目尼龍膜過濾。反復震蕩過濾3 次，收集全部濾液1 000 r/min轉(zhuǎn)離心5 min，棄上清。用新鮮的生長培養(yǎng)基重懸細胞，移至培養(yǎng)皿中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)40 min；如此反復差貼3次，以消除成纖維細胞。

1.4 功能驗證

將let-7b過表達載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b轉(zhuǎn)染至成肌細胞，并同時設空質(zhì)粒對照。具體方法為：50 μL OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋600ng let-7b過表達載體，輕柔混勻室溫孵育5 min；50 μL OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋2 μL Lipofectamine 2000試劑后輕柔混勻室溫孵育5 min；將上述兩樣品混合，室溫孵育20 min后直接將復合物加到含0.4 mL OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基的細胞中，來回搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻；于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后換0.5 mL含10%FBS，不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，不同時間組分別設3個重復。

用MTT法測定OD值[10]。轉(zhuǎn)染后，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每個時間點設5個平行樣品。每孔加入MTT (5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸盡培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO 振蕩10 min。在酶標儀上讀取OD值，檢測波長570 nm。取每個時間點3個平行樣品的平均值，根據(jù)OD值繪制細胞的生長曲線。

qPCR檢測基因表達量：采用實時熒光定量PCR 的方法檢測let-7b 、IGF2BP3、IGF2、IGF2R、IGF1和IGF1R的表達，具體方法見參考文獻[7]，引物信息見表3。

表3 qRT-PCR引物的信息Table 3 Sequences of primers used for qRT-PCR

采用Western blot測定其靶基因的蛋白質(zhì)表達量。ELISA檢測，依照蛋白質(zhì)種類的不同依照所購試劑盒的說明書操作。

1.5 統(tǒng)計分析

實時熒光定量PCR 結(jié)果采用2-ΔCt分析IGF2BP3、IGF2、IGF1等基因相對于GAPDH基因、let-7b相對于18S的表達。雙熒光素酶檢測結(jié)果采用螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性比進行分析。試驗數(shù)據(jù)以“均值±標準誤”表示，組間比較采用SPSS12.0 軟件的t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA let-7b與靶基因IGF2BP3 3'UTR的雙熒光素酶驗證

共轉(zhuǎn)染IGF2BP3 3'UTR熒光素酶報告與let-7b過表達載體到DF-1細胞，雙熒光素酶驗證結(jié)果顯示，let-7b過表達載體與IGF2BP3 驗證載體共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對活性明顯下降，表明let-7b能夠抑制IGF2BP3 的 3'UTR熒光素酶報告基因的活性；而當結(jié)合let-7b的位點突變后，這種抑制作用大大降低，表明let-7b與靶基因IGF2BP3有確切的靶標關系(圖1)。

圖1 let-7b與靶基因IGF2BP3 3'UTR靶標螢火蟲/海腎雙熒光素酶驗證Fig.1 Validation of luc2/hRluc-neo between let-7b and IGF2BP3

2.2 miRNA let-7b對成肌細胞增殖的影響

將let-7b過表達載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b轉(zhuǎn)染到成肌細胞，并同時設空質(zhì)粒對照。在細胞培育0h、24h、48h、72h后，采用MTT檢測試劑盒對細胞增殖情況進行鑒定，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，let-7b過表達載體轉(zhuǎn)染成肌細胞后，與空質(zhì)粒組相比，細胞增殖受到一定程度的影響，細胞數(shù)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。

2.3 miRNA let-7b對靶基因IGF2BP3與相關基因的mRNA表達量的影響

將let-7b過表達載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b轉(zhuǎn)染成肌細胞，同時設置空質(zhì)粒對照組。細胞培養(yǎng)36h后，分別收集細胞并提取總RNA，并同時進行熒光定量分析(見圖3)。從圖3中可見，let-7b過表達載體轉(zhuǎn)染成肌細胞后，let-7b的表達量為空質(zhì)粒對照組的3.09倍，差異極顯著(P<0.01)，其靶基因 IGF2BP3的mRNA表達量則下調(diào)了2.33倍，差異顯著(P<0.05)，說明let-7b對IGF2BP3基因有負向調(diào)控作用。而IGF2、IGF1的mRNA表達量有一定程度的變化，但差異不顯著(P>0.05)。

圖2 miRNA let-7b對成肌細胞增殖的影響Fig.2 Effects of miRNA let-7b on myoblast proliferation

2.4 miRNA let-7b對靶基因IGF2BP3的蛋白質(zhì)表達量的影響

把let-7b過表達載體pcDNA-EGFP-pre-let-7b轉(zhuǎn)染成肌細胞，并且設置空質(zhì)粒對照組。細胞培養(yǎng)36 h后，對成肌細胞的蛋白質(zhì)表達量進行western blotting和ELISA分析，結(jié)果見圖4、圖5。

從圖4可知，let-7b轉(zhuǎn)染成肌細胞36 h后，IGF2BP3的蛋白質(zhì)表達量明顯減少，這與上述let-7b過表達可使IGF2BP3基因mRNA表達量下調(diào)2.33倍的結(jié)果相一致。

圖3 miRNA let-7b對靶基因IGF2BP3及相關基因的mRNA表達量的影響Fig.3 Effects of miRNA let-7b on mRNA expression of target gene IGF2BP3 and related genes

圖4 miRNA let-7b對成肌細胞IGF2BP3蛋白質(zhì)表達量的影響Fig.4 Effect of miRNA let-7b on the expression of IGF2BP3 protein in myoblasts

圖5 let-7b對成肌細胞IGF2、IGF1表達量的影響Fig. 5 Effects of let-7b on the expression of IGF2 and IGF1 in myoblasts

從圖5可知，根據(jù)ELISA分析，let-7b轉(zhuǎn)染成肌細胞24 h，IGF2的蛋白質(zhì)表達量與空質(zhì)粒對照組比較，下降了57.1%，差異顯著(P<0.05)，但在轉(zhuǎn)染后36 h，IGF2的蛋白質(zhì)表達量與空質(zhì)粒對照組接近，差別不顯著(P>0.05)，說明let-7b對IGF2的蛋白質(zhì)表達的影響隨時間的延長而逐漸減弱(見圖5A)。從ELISA分析結(jié)果來看，把let-7b轉(zhuǎn)染到成肌細胞24h后，IGF1的蛋白質(zhì)表達量與空質(zhì)粒對照組相比下降了8.4%，差異不顯著(P>0.05)，但在轉(zhuǎn)染后36h，IGF1的蛋白質(zhì)表達量與空質(zhì)粒對照組相比較，下降了24.5%，差異顯著(P<0.05)，說明let-7b對IGF1的蛋白質(zhì)表達的影響隨時間的延長而逐漸增強(見圖5B)。

3 討 論

骨骼肌的生長發(fā)育過程涉及多基因調(diào)控，受許多細胞因子的調(diào)理，過程非常繁瑣。miRNA是一類長度約為22 nt的非編碼小分子單鏈 RNA，在動物體內(nèi)廣泛存在并參與調(diào)節(jié)動物的生長、發(fā)育等一系列生命過程。miRNA經(jīng)過與靶基因mRNA相結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄程度上導致靶基因mRNA的降解或翻譯的抑制，參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

IGF2BP3作為一種轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控因子，主要參與胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生而受到廣泛重視[11]。對IGF2BP3的研究主要集中在動物癌細胞的調(diào)控機制方面，大量研究表明，IGF2BP3對促進癌癥細胞的增殖具有重要作用[12-13]。有關IGF2BP3參與調(diào)控雞生長發(fā)育的研究報道很少。本研究在前期靶基因預測的基礎上，通過let-7b過表達載體轉(zhuǎn)染至DF-1細胞進行雙熒光素酶靶標驗證，證明miRNA let-7b對IGF2BP3基因具有靶向調(diào)控作用。為了進一步觀察miRNA let-7b對骨骼肌成肌細胞生長發(fā)育的調(diào)控作用，將let-7b過表達載體轉(zhuǎn)染成肌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)let-7b對細胞增殖產(chǎn)生了明顯影響。從mRNA的表達情況來看，與骨骼肌生長發(fā)育相關基因中，只有l(wèi)et-7b的靶基因IGF2BP3明顯下調(diào)，而IGF2、IGF1的mRNA表達量則變動不大。與此同時，western blotting分析發(fā)現(xiàn)，IGF2BP3的蛋白質(zhì)表達量也同步下降。ELISA分析發(fā)現(xiàn)，let-7b轉(zhuǎn)染24 h時IGF2的蛋白質(zhì)含量明顯下調(diào)，36 h后恢復正常水平，推測let-7b可使IGF2BP3表達量下降，但對IGF2 mRNA的表達影響不大，它的影響主要是使IGF2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運效率降低，而且其影響會隨時間的延長而逐漸下降；let-7b轉(zhuǎn)染成肌細胞24 h后IGF1的表達量受到一定影響，36 h后則明顯下調(diào)，但其作用機理尚不清楚。

研究表明，IGF2BP3是胰島素樣生長因子RNA結(jié)合蛋白家族中的一個重要成員，可以高度特異地與編碼IGF2的mRNA結(jié)合，是一種能夠與胰島素樣生長因子(IGFs)相結(jié)合的分泌性蛋白，參加RNA的運輸、穩(wěn)定、細胞的增殖和遷移[14-15]。IGF2BP3與IGFs結(jié)合能夠調(diào)控IGFs與IGF2受體間的互相作用，改變其促有絲分裂效應，調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、凋亡、黏附和運動[16]。IGF2(insulin-like growth factor 2)基因又稱生長調(diào)節(jié)素A(somatomedin A)，是動物生長軸上重要的因子，也是一種多功能細胞增殖調(diào)控因子，在細胞的分化、增殖，胚胎的生長發(fā)育以及腫瘤細胞中具有重要的作用。胰島素樣生長因子通過自分泌/旁分泌機制在禽類胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[17]。

綜上可見，miRNA let-7b對雞成肌細胞增殖效果的影響，主要是通過靶向調(diào)控IGF2BP3的mRNA表達，進而影響其蛋白質(zhì)表水平。而IGF2BP3表達水平的下降，又進一步影響到IGF2的運輸、穩(wěn)定和遷移功能，從而影響成肌細胞的增殖。

4 結(jié) 論

通過let-7b過表達載體轉(zhuǎn)染DF-1細胞進行雙熒光素酶靶標驗證，證明miRNA let-7b對IGF2BP3基因具有靶向調(diào)控作用。進一步分析表明，miRNA let-7b主要是通過靶向調(diào)控IGF2BP3的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平，并進一步影響IGF2的運輸、穩(wěn)定和遷移功能而影響成肌細胞的增殖。

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