淫羊藿苷對脂多糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞炎癥因子表達的影響及機制研究

吳 迪，楊 滔，杜 清

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥學(xué)實驗教學(xué)示范中心，貴州 遵義 563099)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發(fā)病機制復(fù)雜，大量實驗研究表明，炎癥反應(yīng)及炎癥因子的大量產(chǎn)生在AS的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，血管內(nèi)皮細胞的炎癥損傷啟動AS的進程[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是覆蓋在革蘭氏陰性菌細胞壁外膜黏肽上的一種脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物，可誘導(dǎo)失控性炎癥反應(yīng)。TOLL樣受體(Toll-like receptors,TLRs)在慢性炎癥反應(yīng)中起重要作用，TLR4能特異性地識別配體LPS，當(dāng)內(nèi)皮細胞受到LPS刺激時，TLR4被激活，進而激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子的大量表達，從而引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[2-4]。淫羊藿苷(icariin,ICA)來源于中藥植物淫羊藿，屬于黃酮醇苷類化合物?，F(xiàn)有研究證實，淫羊藿苷具有一定的抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用[5-7]，淫羊藿及淫羊藿苷在心血管保護方面具有較好的作用，且淫羊藿苷對AS的作用研究少有報道。本研究擬觀察ICA對LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)表達相關(guān)炎癥因子如C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)的影響，探討其抑制TLR4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并初步研究可能的機制，從而為臨床治療AS等炎癥疾病提供實驗依據(jù)和可能的新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，臍帶來源于健康足月剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，標(biāo)本取自遵義市人民醫(yī)院產(chǎn)科(征得產(chǎn)婦同意)。

1.1.2 試劑 ECM 培養(yǎng)基(美國Sciencell公司)；膠原酶Ⅰ型、明膠、LPS(美國sigma公司)；肝素鈉(北京鼎國公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素(美國Hyclone公司)；Ⅷ因子相關(guān)抗原兔抗人抗體、DAB 顯色試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(上海碧云天公司)；TLR4、NF-κB一抗(美國Abcam公司)；TAK-242(美國APExBIO公司)；CRP、IL-6酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)；淫羊藿苷(南京澤朗醫(yī)藥技術(shù)有限公司，經(jīng)HPLC測定純度≥98%)。

1.1.3 儀器 電泳儀(美國Bio-Rad公司，Powerpac Universal)，酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，Multiskan)，生物安全柜(蘇州金凈凈化設(shè)備公司，BHC-1300A2)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，3111)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司，IX73)。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng) 取新鮮臍帶(遵義市人民醫(yī)院提供，產(chǎn)婦知情同意)約20 cm，用預(yù)冷的無菌PBS(含2 g/L肝素鈉)運輸新鮮臍帶，運輸時間不超過2 h。在超凈工作臺中使用無菌PBS(室溫)沖洗臍帶，減掉受損部位。用止血鉗夾閉臍帶一端，從另一端灌注預(yù)熱的0.2%的膠原酶Ⅰ至臍帶充盈，用止血鉗夾閉臍帶。將夾閉好的臍帶放入PBS溶液中，37 ℃孵育10 min，每隔3 min輕揉臍帶1次。孵育結(jié)束收集消化液，使用完全培養(yǎng)液(含10%FBS的ECM培養(yǎng)液)沖洗臍靜脈管腔2次，收集沖洗液。合并消化液與沖洗液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)液重懸細胞后再次離心。最后，棄上清液，加入3～5 mL完全培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞液接種到25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，于5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換培養(yǎng)液，待細胞生長至約80%融合時，加入0.25%胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。采用形態(tài)學(xué)觀察和免疫細胞化學(xué)染色Ⅷ因子抗體免疫組化學(xué)鑒定為HUVECs后，將2～7代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組 實驗分為空白對照組；脂多糖模型組(10 μg/mL的LPS刺激24 h)；淫羊藿苷實驗組，分3個亞組，即1、10、50 μmol/L淫羊藿苷預(yù)孵育24 h后再加入10 μg/mL的LPS刺激24 h；機制研究組，給予TLR4抑制劑TAK-242(1 μmol/L)處理細胞1 h后加入50 μmol/L淫羊藿苷，24 h后加入10 μg/mL LPS，LPS作用時間24 h。

1.2.3 MTT檢測細胞活力 HUVECs接種于96孔板中，接種密度約1×105/孔，每孔100 μL。細胞貼壁后，分別將培養(yǎng)基更換為不含或含有0.1、1、10、50、100 μmol/L淫羊藿苷，0.1、1、10、50、100 μg/mL脂多糖的培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h后，加入0.5%的MTT溶液，每孔20 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μLDMSO，振搖10 min后490 nm下檢測溶液的吸光度值(OD)，并計算細胞存活率，計算公式為：

存活率(%)=OD實驗組/ OD對照孔×100。

1.2.4 Western-blot法檢測TLR4及NF-κB蛋白表達 HUVECs細胞接種于6孔板中，接種密度約1×105/孔，細胞貼壁長至80%融合時，更換培養(yǎng)基，按照實驗分組給藥。藥物刺激結(jié)束后，PBS沖洗細胞3遍，吸凈PBS。加入RIPA裂解液，冰上裂解細胞20 min，然后收集裂解液于預(yù)冷的去酶EP管中，4 ℃，12 000 r/min離心15 min?？偟鞍资褂肂CA法定量后加入上樣緩沖液變性5 min。取20 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后加一抗4 ℃[兔抗人(TLR4，1∶800)，(NF-κB，1∶1 000)]孵育過夜。TBST洗膜后，加二抗(羊抗兔1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜4次后ECL試劑盒發(fā)光，使用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，imageJ軟件進行光密度值分析，平行重復(fù)實驗3次。

1.2.5 ELISA檢測CRP、IL-6蛋白含量 HUVECs細胞接種于96孔板中，接種密度約1×105/孔，每孔100 μL，貼壁后，按照實驗分組給藥，將培養(yǎng)基更換為不含或含有藥物的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔。藥物刺激結(jié)束后，用ELISA試劑盒檢測細胞上清液中CRP、IL-6的含量。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮細胞的形態(tài)觀察及免疫組化鑒定結(jié)果 倒置顯微鏡下，1～3 d可見多數(shù)HUVECs成團聚集，團聚細胞多呈長梭型，細胞首尾相連或渦旋狀排列(見圖1A)。4 d左右可達80%融合，融合的細胞多呈短梭型，典型鵝卵石樣緊密排列，胞核清晰可見(見圖1B)。使用免疫細胞化學(xué)染色第Ⅷ因子，鑒定培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞。結(jié)果顯示，99%的細胞染色陽性，胞核不著色，胞漿紅棕色(見圖1C)。

A：培養(yǎng)24 h后的原代HUVECs(×200)；B：培養(yǎng)的第7代的HUVECs (×200)；C：第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細胞化學(xué)鑒定(×400)。圖1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的形態(tài)及鑒定

2.2 淫羊藿苷、脂多糖對HUVECs活力的影響 與空白對照組相比，不同濃度的淫羊藿苷對細胞存活率影響不大，高濃度(100 μmol/L)淫羊藿苷降低細胞存活率，實驗選擇50 μmol/L淫羊藿苷做最大刺激劑量。與空白對照組相比，50和100 μg/mL的脂多糖明顯減低細胞存活率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，其抑制率在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性，實驗選擇10 μg/mL作為模型組刺激劑量，MTT結(jié)果見圖2。

經(jīng)單因素方差分析，與空白對照組(淫羊藿苷或脂多糖濃度為0)相比，*** P<0.001。n=6,±s。圖2 淫羊藿苷、脂多糖對HUVECs活力的影響

2.3 淫羊藿苷對脂多糖誘導(dǎo)HUVECs TLR4及NF-κB蛋白的影響 與空白組相比，LPS模型組TLR4及NF-κB蛋白表達上調(diào)(P<0.05)。與模型組對比，實驗組淫羊藿苷(1、10和50 μmol/L)濃度依賴性地下調(diào)TLR4及NF-κB蛋白的表達(P<0.05)。加入TLR4抑制劑后，TLR4及NF-κB蛋白的表達較模型組降低(P<0.05)，但下調(diào)作用不如50 μmol/L的淫羊藿苷，TAK-242可以抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4及NF-κB的增加(P<0.05)。實驗結(jié)果提示，淫羊藿苷對脂多糖誘導(dǎo)的HUVECs損傷具有保護作用，且與細胞內(nèi)TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)(見圖3)。

經(jīng)單因素方差分析，與空白組(Control)相比，** P<0.01，* P<0.05；與模型組(LPS)相比，### P<0.001，# P<0.05；與實驗組(LPS+50 μmol/L ICA)相比，★P<0.05，n=3,±s。圖3 ICA對LPS誘導(dǎo)的HUVECs TLR4及NF-κB蛋白的影響

2.4 淫羊藿苷對脂多糖誘導(dǎo)HUVECs上清液中CRP、IL-6質(zhì)量濃度的影響 與空白組相比，脂多糖誘導(dǎo)的HUVECs上清液中CRP、IL-6質(zhì)量濃度明顯升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與LPS模型組對比，淫羊藿苷預(yù)處理后的HUVECs上清液中CRP、IL-6質(zhì)量濃度明顯下降，且中、高濃度淫羊藿苷的下調(diào)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。加入TLR4抑制劑后，CRP、IL-6蛋白的表達較模型組降低(P<0.05)，但其下調(diào)作用不如50 μmol/L的淫羊藿苷。說明，淫羊藿苷對脂多糖誘導(dǎo)的HUVECs炎癥因子的表達具有抑制作用，且與細胞內(nèi)TLR4/NF-κB/CRP，IL-6信號通路相關(guān)。ELISA結(jié)果見表1。

組別ρCRP(pg/mL)ρIL-6(pg/mL)空白54.98±2.9736.02±1.69模型68.90±5.14***48.43±6.10**淫羊藿苷低劑量65.15±4.7544.40±3.87淫羊藿苷中劑量55.54±5.30##38.44±4.42#淫羊藿苷高劑量46.74±5.92###31.04±3.41###機制研究54.24±7.98★35.21±4.93

經(jīng)單因素方差分析，與空白組相比，**P<0.01，***P<0.001；與模型組相比，##P<0.01，#P<0.05；與實驗組(淫羊藿苷高劑量組)相比，★P<0.05。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種多因素疾病，其發(fā)病機制極其復(fù)雜，炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。不論從脂紋現(xiàn)象到斑塊形成乃至臨床事件的各個階段，動脈粥樣硬化都可以看作是血管對損傷的炎癥反應(yīng)。內(nèi)皮細胞受損導(dǎo)致炎癥細胞因子的大量釋放是動脈粥樣硬化的起始[8-9]。脂多糖是血管內(nèi)皮最強的刺激因子之一，能觸發(fā)并加速炎癥反應(yīng)，刺激炎性細胞因子的“瀑級式”生成[10]。TLRs是模式識別受體，是慢性炎癥、免疫反應(yīng)和脂質(zhì)代謝紊亂間的重要橋梁，激活TLRs能引起慢性炎癥反應(yīng)[4]。TLR4作為一種跨膜受體蛋白，在內(nèi)皮細胞中有高表達，其膜外的24個含亮氨酸重復(fù)序列能特異性地識別脂多糖[3]。NF-κB是炎癥中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下，NF-κB由P50/P65/IKB(抑制因子)三聚體組成?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，內(nèi)皮細胞受到脂多糖刺激后，TLR4信號通路被激活，TLR4刺激IKB的磷酸化、泛素化及相關(guān)蛋白酶的水解，激活NF-κB，使其進入細胞核，與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)基因的啟動子或增強子結(jié)合位點相結(jié)合，誘導(dǎo)相應(yīng)的炎癥因子的大量表達，如CRP、TNF-α、IL-6和IL-1β等，進而引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細胞功能障礙及組織損傷，從而加速動脈粥樣硬化的進程[11-12]。

胡彥武等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能夠下調(diào)動脈粥樣硬化大鼠的血脂水平，通過降低氧化低密度脂蛋白的生成從而抑制高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠動脈粥樣硬化，機制涉及抑制ERK1/2、p38 MAPK信號通路的激活，進而抑制血管平滑肌細胞增殖，也可能與阻斷JNK、p38 MAPK和NF-κB信號通路激活而抑制血管內(nèi)皮細胞損傷及凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，淫羊藿苷預(yù)處理可以減輕脂多糖對內(nèi)皮細胞的炎癥損傷，抑制脂多糖誘導(dǎo)的TLR4、NF-κB、CRP及IL-6蛋白水平的升高，顯示淫羊藿苷對脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的炎癥損傷具有一定的保護作用，提示淫羊藿苷在動脈粥樣硬化防治方面的研究意義。另一方面，本研究的結(jié)果表明，淫羊藿苷的抗炎作用機制與抑制TLR4信號通路、降低NF-κB的表達，進一步減小炎癥因子CRP及IL-6的釋放量相關(guān)。這一結(jié)果與研究者對動脈粥樣硬化炎癥機制研究有一致性。

炎癥反應(yīng)貫穿于動脈粥樣硬化的全過程，炎癥細胞因子促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生。CRP是炎癥急性時相的反應(yīng)產(chǎn)物，動脈粥樣硬化斑塊組織、肝臟、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等均可產(chǎn)生CRP。研究數(shù)據(jù)表明，動脈粥樣斑塊中的CRP比正常動脈組織中高10倍，且斑塊病變部位的細胞大量合成并分泌CRP。CRP能劑量依賴性誘導(dǎo)炎性因子的表達，如IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等，并通過與單核巨噬細胞的相互作用發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。CRP能夠誘導(dǎo)人臍靜脈細胞單核細胞趨化因子1的產(chǎn)生與分泌，單核細胞趨化因子1的高表達進一步促進動脈粥樣硬化，增加心肌梗死的風(fēng)險。CRP既是細胞炎癥因子，又是促炎因子，直接參與動脈粥樣硬化的進程[13-15]。IL-6在脂質(zhì)穩(wěn)定性、血管重塑及斑塊的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。動脈粥樣硬化病灶的主要細胞：血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞和T細胞均能分泌IL-6。Seino等[16]的研究顯示，IL-6在動脈粥樣硬化斑塊局部和粥樣硬化損傷的動脈壁上均有表達，且表達量是正常組織的10～40倍。Rus等[17]的結(jié)果證實，IL-6在正常動脈壁中有沉積，但在動脈粥樣斑塊中表達顯著增加。Tzoulaki等[12]對1 592名年齡為55～74的人群中細胞因子和As發(fā)生之間的關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)CRP、IL-6及細胞間粘附分子-1均與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)，且IL-6的相關(guān)性更大。以上研究結(jié)果皆提示，炎癥細胞因子CRP、IL-6和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。

綜上所述，淫羊藿苷通過抑制TLR4信號通路的激活，進而降低炎癥因子CRP、IL-6的產(chǎn)生來減輕脂多糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的炎癥損傷，延緩動脈粥樣硬化的進程。淫羊藿苷在動脈粥樣硬化的防治方面具有進一步的研究意義，其具體的作用機制還需更深入的體內(nèi)及體外研究來證實。

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