膀胱出口部分梗阻動物模型的研究進展

陳 林, 楊亞飛, 楊 進, 何平林, 王 凱, 王云漢, 汪自力

(1. 成都大學附屬醫(yī)院泌尿外科, 成都610081; 2. 遵義醫(yī)學院, 遵義 563000)

膀胱出口部分梗阻(partial bladder outlet obstruction,pBOO)是一種常見的慢性泌尿系統(tǒng)疾病，其特征表現(xiàn)是膀胱病理性肥大，膠原沉積和尿潴留[1]。pBOO可由多種病因引起, 包括良性前列腺增生, 尿道狹窄和前列腺術后的膀胱頸攣縮等[2,3]。受累人群非常廣泛。以前列腺增生為例，流行病學研究表明, 70歲及以上的男性患病率最高[4], 26.2%的男性患者一生中會罹患不同程度的前列腺增生[5]，隨著我國人口老齡化加劇，該疾病的家庭負擔和社會負擔將極為嚴重。如果沒有良好的藥物或技術控制疾病，患者排尿功能障礙加重必然導致腎臟功能損害甚至尿毒癥等一系列嚴重后果[6,7]。因此, 越來越多的研究者將目光轉至膀胱梗阻性疾病的基礎研究中，這對梗阻性膀胱疾病的發(fā)病機制研究具有重要現(xiàn)實意義。為了觀察機體的整體狀態(tài)，從現(xiàn)象到本質完整觀察疾病的病理生理狀態(tài)，合理使用動物構建疾病模型的方法仍然是不可替代的[8]。該領域近年來新報道較多，國內相關綜述少且較陳舊[9],本文就pBOO動物模型的造模方法選擇等研究進展進行綜述。

1 膀胱頸結扎

自1982年以來，開放手術膀胱頸結扎法一直是構建pBOO動物模型使用最廣泛也較為成熟的方法[10]。開放手術誘導的pBOO模型能夠包含臨床上所觀察到的大多數(shù)臨床特征。目前臨床上診斷pBOO的金標準為尿流動力學檢測[11]，其中壓力-流率測定(pressure-flow study，PFS)常呈現(xiàn)“高壓低流”的特點。有學者[2,12]應用膀胱頸結扎法在大鼠中成功構建pBOO動物模型，行膀胱充盈測壓檢測可見其膀胱壓力曲線圖示，具體方法如下: 動物稱重后，腹腔注射或氣體吸入麻醉, 仰臥位平放小鼠。碘伏消毒會陰處，將直徑為1 mm的硬膜外導管經尿道外口插入膀胱，以此作為尿道支撐，并發(fā)揮校準棒的功能。下腹部行縱行切口后逐層切開皮膚及皮下組織, 鈍性分離出膀胱頸周圍組織，仔細游離膀胱-尿道交界處，游離近端尿道，避免因誤扎兩側輸尿管引起上尿路梗阻或腎積水。近端尿道穿過3-0絲線, 結扎近端尿道, 拔除尿道內導管逐層縫合關閉腹部。目前對結扎膀胱頸造成pBOO模型所需校準棒的直徑大小尚無統(tǒng)一的標準。雄鼠由于尿道外口暴露不明顯而且尿道彎曲，其校準棒直徑多在2 mm以內，雌鼠因其尿道外口暴露明顯且尿道直，校準物的金屬棒外徑多為1 mm，雌鼠具有解剖簡單，方便導尿的特點，因此國內外文獻中動物模型造模以雌性為主。校準棒的放置位置目前也無統(tǒng)一標準，可通過導尿的方式經尿道插入導尿管，以導尿管作為校準棒，結扎縫合造成梗阻。也有將校準棒直接與雌鼠尿道緊貼，縫合尿道后抽出校準棒的方式建立模型，此種方式梗阻程度與校準棒直徑呈正相關關系。該方法具有簡便、可操作性強以及造模時間短的特點，是一種快速、簡便的pBOO造模方法。

但是隨著pBOO研究的廣泛開展，學者們對膀胱頸結扎構建pBOO動物模型的穩(wěn)定性和可重復性提出質疑，除傳統(tǒng)的經膀胱頸構建pBOO動物模型高達15%的死亡率飽受詬病外[13]，開放手術相關的并發(fā)癥可能損害膀胱血供并導致膀胱神經支配異常，也使這一傳統(tǒng)模型備受質疑。Sidler等[14]研究表明，膀胱頸周圍的侵入性解剖操作破壞了膀胱的部分神經支配，并通過去神經支配破壞了膀胱頸與膀胱體之間的神經交互聯(lián)系。即使是在除去結扎近端尿道，其余步驟同膀胱頸結扎法的假手術組中，也出現(xiàn)膀胱重量增加和膀胱功能障礙，這可能與去神經損傷有關，因此不能作為非神經源性pBOO的對照組動物模型。

最新的一些研究[6,15]已證實膀胱缺血和氧化應激介導pBOO中的膀胱壁重塑，此前機械刺激被認為是引起這一效應的主要原因[16]。研究人員就pBOO的發(fā)病機制得出了截然不同的結論，表明傳統(tǒng)開放手術動物模型不夠穩(wěn)定，并且這些變化可能不容易被檢測到。傳統(tǒng)開放手術動物模型可能與臨床上的pBOO患者具有不同的發(fā)病機制和病理生理過程?；谝陨显颍袑W者[14]在傳統(tǒng)膀胱頸結扎法的基礎上進行優(yōu)化，發(fā)明了保留神經的尿道中段梗阻術，具體做法是在雌性小鼠插入24G血管導管作為導尿管，恥骨聯(lián)合向尿道口施行約6 mm縱行皮膚切口，顯微剪鈍性分離帶有尿道管支架的尿道，仔細解剖出尿道周圍的神經血管束避免損傷，分離出在尿道與陰道之間的縱行平面，穿過5-0不可吸收絲線，外科結縫合結扎尿道，拔除尿道內導管造成梗阻，逐層縫合。結果顯示與傳統(tǒng)結扎膀胱頸法相比，保留神經的尿道中段梗阻術能更為準確控制梗阻程度，出現(xiàn)殘余尿增加和膀胱纖維化的改變，但梗阻的膀胱不會顯著擴大，更加貼合臨床的膀胱梗阻性疾病的病理生理過程，也可避免腹部切口愈合過程中炎癥以及膀胱與腹壁的粘連發(fā)生(這兩方面會進一步引起膀胱功能障礙)。但即便如此，膀胱頸結扎依然是目前應用最廣泛，也最被學術界認可的構建pBOO動物模型的方式。

2 經會陰途徑結扎

為了避免經腹pBOO模型的這些缺點，Zhang等[17]報告了結扎會陰造成近端尿道梗阻模型: 麻醉大鼠后，暴露尿道并用直徑1 mm的硬膜外導管通過尿道口插入膀胱。小心分離出尿道和陰道，并用4-0帶線縫合針穿過會陰尿道周圍。該手術不需要低位腹部切口，可避免損傷膀胱及其神經支配和尿道周圍血管[18]。但該方法在縫合會陰尿道時只能盲目進針縫合，縫合深度無法定量操作，對術者技術要求較高。在此基礎上，本課題組進一步創(chuàng)新實驗思路，將大鼠尿道外口梗阻1/3面積，能得到與膀胱頸結扎類似的病理生理改變，最接近傳統(tǒng)膀胱頸結扎法誘導pBOO病理生理過程中的最佳梗阻程度[19]。該動物模型能得到與經腹腔途徑在組織學改變和膀胱充盈測壓數(shù)據(jù)方面相近的結果。

另有學者[20]根據(jù)雄性大鼠的尿道解剖特點，從陰莖與陰囊連接部分離出陰莖海綿體，鈍性分離出尿道球部后，適度結扎形成尿路梗阻。經會陰途徑的pBOO動物模型構建能減少炎癥反應，具有更簡單的解剖結構，手術方式簡單，更加接近臨床上的pBOO病理生理過程。但作為一種方法論研究，該方法也存在一些局限性。Kim等[21]報道經會陰模型中pBOO致膀胱過度活動的尿動力學參數(shù)改變不如經腹模型明顯，因此經會陰方法在模擬膀胱過度活動癥時可能效果不佳。此外，可能損傷雄性鼠的勃起功能，因為經會陰進入膀胱不可避免造成海綿體損傷。

3 建立人工束縛環(huán)

pBOO定義是指膀胱頸或尿道由于多種病因引起尿液流出道阻力升高導致的尿液排出困難，出現(xiàn)尿潴留甚至損傷腎功能的疾病類型。據(jù)此定義，有學者[22]嘗試在膀胱頸至尿道這一段解剖位置處將硅膠或金屬環(huán)、氣囊等不易吸收或變形的材料通過手術方法置入大鼠體內，人為建立束縛環(huán)，模擬膀胱頸流出梗阻或尿道狹窄的病理過程。同時利用異物產生的無菌性炎癥反應，纖維瘢痕增生模型慢性梗阻的生理過程。此種動物模型的選擇以雌性大鼠為主, 可避免膀胱過度充盈, 尿液反流進入精囊腺及附屬腺體，引起膿毒血癥或者膀胱內壓力減少。

此種造模方法是在現(xiàn)代材料學的迅速發(fā)展下建立的，能夠模擬pBOO患者的尿流動力學表現(xiàn)，但由于其存在異物排斥反應和組織相容性差的缺點，目前不能廣泛用于pBOO動物模型構建。另外，目前也無標準的內徑大小對照研究，其梗阻表現(xiàn)缺乏均一性，不能形成一致的梗阻程度。人工束縛環(huán)的建立過程與開放手術造模相比，仍存在較大手術創(chuàng)傷，手術的相關并發(fā)癥可能影響動物模型構建的準確性。因此還需進一步尋找新型材料，使其模型更加標準化，也更加接近臨床病理生理過程。

4 建立前列腺增生

近年研究[23]表明，較高水平的循環(huán)17β-雌二醇(E2)能增加老年男性發(fā)生下尿路癥狀風險，而男性中較低水平的循環(huán)睪酮(T)則會增加pBOO的嚴重程度。隨著年齡的增加, 老年男性睪酮水平下降, 而E2的血清水平保持在相對恒定的水平，但游離T與E2比率的凈效應是下降的, 雄激素和雌激素之間的比例不平衡可能會導致男性患者出現(xiàn)pBOO[24]。過度表達雌激素生物合成的限速酶——芳香化酶的雄性小鼠易發(fā)生pBOO，且伴隨著膀胱尿路上皮和逼尿肌中的形態(tài)學變化以及過度增殖反應[25]。T聯(lián)合使用E2可以模擬老年男性的激素環(huán)境，提高E2/T的比值，用于雄性小鼠可誘導出現(xiàn)前列腺相關的BOO癥狀[26,27]。

利用激素水平的變化構建新型pBOO動物模型的可行性在Nevile等[31]研究中得到了佐證。金屬硫蛋白(MTs)是一種富含半胱氨酸的蛋白質，對金屬有很強的親和力，它參與了前列腺的細胞增殖、凋亡和腫瘤轉化。研究人員[28]成功構建了前列腺特異性表達金屬硫蛋白-1(MT1)的轉基因鼠，但轉基因鼠并未自發(fā)產生前列腺癌和前列腺上皮內瘤變等癌前病變，在所有E2治療小鼠中觀察到前列腺增生，68%的E2聯(lián)合T治療的小鼠中不伴有前列腺增生，但都發(fā)生了膀胱明顯充盈伴尿潴留，癥狀類似于pBOO。因此，這種轉基因動物模型，其對E2誘導的pBOO的易感性增加，可作為構建pBOO動物模型的一種選擇方式。

5 尿道外口注射透明質酸

在兔尿道周圍注射自體脂肪構建pBOO動物模型[29]，其原理是人為縮窄尿道外口面積，造成尿道狹窄，增加尿道阻力。理論上該方法可模擬尿頻、膀胱重量增加等病理生理改變，但是存在感染的風險，以及后期自體脂肪組織吸收，梗阻癥狀自行好轉的局限性。

近年來，隨著新興材料的不斷出現(xiàn)，有學者將目光轉移到利用膨脹劑構建pBOO動物模型。其中以透明質酸為代表，尿道外口均分為12點，在其皮下5、7和11點鐘方向分別注射0.2 mL透明質酸鈉，制作pBOO動物模型[30,31]。通過與傳統(tǒng)膀胱頸結扎法比較，建模后4周采用尿流動力學檢測模型建立后的穩(wěn)定性，蘇木精-伊紅(HE)染色結果顯示可以復制傳統(tǒng)模型中的最大排尿壓力、殘余尿量、最大膀胱容量增加等典型pBOO尿流動力學表現(xiàn)，以及組織病理學中膀胱平滑肌肥大、膠原沉積和間質充血水腫典型的膀胱組織結構變化?？杀苊忾_放手術帶來的感染，結扎程度不均一等并發(fā)癥，操作更為簡單，但由于透明質酸價格高昂，制作成本高，不適合用于大批次動物造模，因此，透明質酸尿道外口注射法可以作為一種候選的pBOO動物模型。

6 總結與展望

本文對pBOO動物模型的制作方法，包括傳統(tǒng)制作方法、改良模型和新開發(fā)動物模型的優(yōu)劣勢進行了綜述，目前尚無能完全模擬臨床慢性下尿路梗阻的動物模型。其發(fā)病機制受到性別、年齡、性激素及飲食習慣等多種因素的影響，選擇一種重復性好，能夠再現(xiàn)大部分臨床患者情況的動物模型對尋找新藥靶點，延緩膀胱梗阻性疾病進展具有重要的科學和臨床意義。

隨著研究的進一步深入，僅僅出現(xiàn)下尿路梗阻表現(xiàn)已不能滿足科學研究的需要，構建能與臨床患者病理生理過程一致的動物模型，是目前泌尿外科醫(yī)師和其他研究者需要關心和解決的問題。同時，如何將在動物模型上出現(xiàn)的相關信號通路和分子靶點轉化到臨床患者上，也是一個需要攻克的難題。值得注意的是，無論使用什么類型的模型，將動物研究的結果推廣至臨床應用時應格外謹慎。因此，仍需要在現(xiàn)有研究基礎上，對pBOO動物模型開展進一步的探索和思考，以期能構建更為符合臨床實際的動物模型，為尋找治療膀胱梗阻性疾病的合理有效的分子藥物靶點打下基礎。