小鼠骨髓和睪丸細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)染色體制備中的應(yīng)用比較

黃偉偉，李紹軍，高梅，張斌

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

染色質(zhì)是細(xì)胞遺傳密碼的物質(zhì)載體，也是細(xì)胞代謝和遺傳活動(dòng)的調(diào)控基礎(chǔ)。染色體制備技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)及遺傳學(xué)的核心基礎(chǔ)技術(shù)之一，綜合院校的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程大都包含染色體制備實(shí)驗(yàn)。然而染色體制備技術(shù)復(fù)雜，操作環(huán)節(jié)多，耗時(shí)長，影響因素多，在實(shí)際實(shí)施過程中獲得理想染色體的成功率很低，因此需要進(jìn)一步改進(jìn)優(yōu)化，提高成功率，使學(xué)生能夠真正掌握染色體標(biāo)本的制備技術(shù)，了解染色體的數(shù)目以及形態(tài)特征[1]。染色體只出現(xiàn)在分裂期的細(xì)胞中，以分裂中期的染色體結(jié)構(gòu)最為典型，因此要想獲得理想的染色體標(biāo)本，前提是獲得足夠的分裂中期細(xì)胞。目前，運(yùn)用最廣泛的方法是體外培養(yǎng)外周血細(xì)胞，利用植物凝集素（PHA）刺激淋巴細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，培養(yǎng)72 h后，再用秋水仙素處理使細(xì)胞周期停滯在分裂中期，再經(jīng)低滲、固定、滴片等處理，獲得可用染色體標(biāo)本。外周血培養(yǎng)法雖然能夠獲得大量的分裂中期細(xì)胞，然而需要進(jìn)行細(xì)胞無菌培養(yǎng)，而且實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長、風(fēng)險(xiǎn)較大，不便于在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中開展。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的骨髓和睪丸細(xì)胞分裂比較旺盛，所以小鼠骨髓或睪丸是實(shí)驗(yàn)教學(xué)中制備染色體較為理想的實(shí)驗(yàn)材料。本文比較了利用小鼠骨髓和睪丸細(xì)胞制備染色體的優(yōu)劣，并討論了染色體制備過程中的注意事項(xiàng)和改進(jìn)方法。

1 秋水仙素處理

為獲得較多的分裂中期細(xì)胞，通常利用秋水仙素能夠結(jié)合微管并阻止微管組裝的特性，實(shí)驗(yàn)前給實(shí)驗(yàn)小鼠注射一定量的秋水仙素，促使骨髓和睪丸中的分裂細(xì)胞停滯在分裂中期。實(shí)驗(yàn)小鼠一般選擇2～3月齡達(dá)到體成熟的昆白鼠，秋水仙素配制為1 mg/mL溶液，一般按照4～6μg/g BW的劑量進(jìn)行腹腔注射，3～4 h后采用脫臼法處死小鼠，分離細(xì)胞。

2 細(xì)胞分離

2.1 骨髓細(xì)胞分離

剪開小鼠腹部和后腿皮膚，從髖關(guān)節(jié)處切開，分離后腿，剝離股骨和脛骨上的肌肉組織，取得完整股骨和脛骨，切去兩端，暴露骨腔；用1 mL注射器吸取2%檸檬酸鈉溶液，通過針頭將溶液注入骨腔中，將骨髓細(xì)胞沖至10 mL離心管中，反復(fù)沖洗骨腔，直至骨髓腔由粉紅變?yōu)榘咨员M可能多地分離獲得骨髓細(xì)胞；摘掉針頭，用注射器輕輕反復(fù)吸打細(xì)胞懸液，將細(xì)胞團(tuán)塊分散為單個(gè)細(xì)胞。

2.2 睪丸細(xì)胞分離

剪開小鼠腹部，暴露腹腔，沿著輸精管查找小鼠睪丸；剪下睪丸，轉(zhuǎn)移至小燒杯中，剪碎；加入3 mL 2%檸檬酸鈉溶液，用玻璃棒進(jìn)一步搗碎；再用膠頭滴管反復(fù)吹打均勻，用鑷子挑出大的組織團(tuán)塊；用注射器取1 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中。

3 染色體制備

3.1 低滲處理

向離心管中加入8 mL預(yù)熱的0.4% KCl溶液（0.075 mol/L），在37℃水浴鍋中低滲處理30 min。

3.2 預(yù)固定

向離心管中滴加新配制的甲醇-冰醋酸固定液1mL，用吸管輕輕吹打1～2 min混勻，1 000 r/min離心8 min，棄去上清。

3.3 固定

加入5 mL新配制的固定液，用吸管輕輕吹打混勻，室溫靜置10 min。1 000 r/min離心8 min，棄去上清。重復(fù)固定2～3次。

3.4 滴片

固定好的細(xì)胞經(jīng)離心后，吸去上清，視細(xì)胞量殘留0.5～1 mL固定液，輕輕吸打形成單細(xì)胞懸液。取出干凈并預(yù)冷的載玻片，以一定垂直高度滴加細(xì)胞懸液，風(fēng)干或者酒精燈烘干。

3.5 染色

將滴加有細(xì)胞的載玻片細(xì)胞面朝上水平放置，滴加1∶10 Giemsa染液3～4 mL，染色10 min，流水沖洗掉染液，干燥后鏡檢。

4 結(jié)果觀察

低倍鏡下觀察細(xì)胞分散轉(zhuǎn)態(tài)和細(xì)胞分布，選擇形態(tài)清晰、分散良好、背景干凈的中期分裂相染色體，用油鏡細(xì)致觀察。理想的中期分裂相染色體形態(tài)應(yīng)為染色體集中分布，每條染色體結(jié)構(gòu)清晰，長度適中，形態(tài)一般程“U”形，著絲粒位置清楚，數(shù)目為2n=40，染色效果好，無染色體纏繞，重疊現(xiàn)象。

5 骨髓和睪丸細(xì)胞制備染色體優(yōu)劣比較

5.1 骨髓細(xì)胞

骨髓細(xì)胞是機(jī)體中分裂比較活躍的細(xì)胞，是制備染色體標(biāo)本較好的細(xì)胞來源。利用骨髓細(xì)胞制備染色體標(biāo)本，可以觀察有絲分裂中期體細(xì)胞染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。然而，為獲得骨髓細(xì)胞，需要對(duì)小鼠進(jìn)行深度解剖，如果學(xué)生缺乏解剖學(xué)知識(shí)，在分離股骨和脛骨過程中會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間；而且在解剖過程中由于氣味和出血，會(huì)使學(xué)生尤其是女生產(chǎn)生厭惡心理而不愿意動(dòng)手；此外，解剖操作不熟練往往導(dǎo)致分離的股骨不完整，致使沖洗得到的骨髓細(xì)胞數(shù)量較少，由于中期分裂相比例很小，進(jìn)而導(dǎo)致染色體制備成功率低，制片后觀察耗費(fèi)時(shí)間長，找到中期分裂相染色體比較困難。

5.2 睪丸細(xì)胞

在雄性小鼠性成熟后，睪丸中的精母細(xì)胞不斷分裂分化，也是制備染色體標(biāo)本較好的細(xì)胞來源，可以觀察減數(shù)分裂不同階段生殖細(xì)胞染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。睪丸的解剖分離相對(duì)比較容易；此外，睪丸體積較大，破碎后會(huì)得到細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多，因此利用睪丸細(xì)胞制備染色體的成功率相對(duì)較高。但實(shí)驗(yàn)過程中只是通過機(jī)械剪切的方式破碎睪丸，細(xì)胞的分離往往不夠徹底，殘留的組織團(tuán)塊較多，會(huì)對(duì)后續(xù)的染色體制備和觀察產(chǎn)生負(fù)面影響，因此，在睪丸破碎后最好用細(xì)胞篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，甚至可以利用擦鏡紙進(jìn)行過濾，以除去殘留的組織塊。

通過比較骨髓細(xì)胞和睪丸細(xì)胞制備染色體的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)睪丸細(xì)胞更有優(yōu)勢，其操作簡單，耗時(shí)較短，細(xì)胞數(shù)目多，成功率高。然而，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，可以同時(shí)利用骨髓細(xì)胞和睪丸細(xì)胞進(jìn)行染色體的制備，一方面可以充實(shí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，提高實(shí)驗(yàn)趣味性；另一方面還可以讓學(xué)生比較兩種細(xì)胞的染色體的差異，加深學(xué)生對(duì)有絲分裂和減數(shù)分裂的認(rèn)識(shí)。

6 染色體制備方法改進(jìn)和注意事項(xiàng)

在實(shí)際教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生制備的染色體標(biāo)本結(jié)果通常是成功率很低，鏡檢看到的是數(shù)目較多的間期細(xì)胞，中期分裂相很少，染色體分散性差，形態(tài)結(jié)構(gòu)不典型[1]。因此，除了選擇合適的細(xì)胞材料，還需要做好以下幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的處理，才能得到理想的中期染色體。

6.1 分裂中期細(xì)胞獲取

中期分裂相細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量是成功制備染色體的基礎(chǔ)。中期分裂相細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量可以從3個(gè)方面進(jìn)行控制：（1）小鼠質(zhì)量，一般應(yīng)選擇2～3月齡體成熟的雄性昆白鼠，體重應(yīng)在25～35 g；（2）刺激骨髓細(xì)胞分裂，可以預(yù)先24 h采取腹腔注射淀粉湯，剪掉一小塊皮膚，甚至人為制造炎癥和刺激造血，以促進(jìn)骨髓細(xì)胞分裂增殖[2]；（3）分裂中期細(xì)胞阻滯，通常通過腹腔注射秋水仙素以引起骨髓細(xì)胞和睪丸細(xì)胞周期停滯在分裂中期，關(guān)鍵在于秋水仙素的注射劑量和處理時(shí)間。通常采用4 μg/g BW的劑量提前處理3～4 h來阻斷骨髓細(xì)胞分裂，而對(duì)于睪丸細(xì)胞，有研究證實(shí)提前6 h注射6 μg/g BW的秋水仙素效果較好。

6.2 低滲處理

低滲的目的是通過吸水膨脹，增大細(xì)胞體積，充分分散染色體，防止染色體纏繞。低滲處理的適當(dāng)與否決定了染色體的分散程度，低滲不充分，染色體分散不徹底，低滲過度，容易造成細(xì)胞破裂。低滲一般使用0.4%KCl溶液，在37 ℃水浴鍋中低滲處理30 min，溶液需要提前預(yù)熱，增強(qiáng)處理效果。同時(shí)低滲溶液的用量盡可能多，以保證低滲效果。筆者的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)是一般細(xì)胞懸液體積控制在1 mL左右，低滲溶液可以添加8 mL。

6.3 固定

固定的目的是穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)。通常需要進(jìn)行固定，首先是預(yù)固定，在低滲處理結(jié)束后，直接加入1 mL甲醇-冰醋酸固定液，混勻1～2 min，以防止細(xì)胞結(jié)塊，離心后再用固定液重復(fù)固定2～3次，每次10 min，以保持染色體形態(tài)。固定液一定要新鮮配制。由于固定液中的甲醇易揮發(fā)、毒性大，可用乙醇替代，效果一致[3]。

6.4 滴片

通過滴片可以破碎細(xì)胞，使染色體分散附著在載玻片上，便于后續(xù)的染色，顯帶等核型分析。因此，滴片也是染色體制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。要做好滴片，首先要提前準(zhǔn)備好載玻片，載玻片必須清潔干凈，不含油脂雜質(zhì)，至少提前4 h冷凍，通過低溫促使液滴擴(kuò)散，使細(xì)胞牢固的附著在載玻片上，同時(shí)通過凍融促進(jìn)細(xì)胞破裂。其次控制好細(xì)胞濃度，由于獲得的骨髓細(xì)胞較少，操作環(huán)節(jié)中可能還有部分細(xì)胞丟失，滴片時(shí)的細(xì)胞數(shù)量一般不是很多，因此在固定離心后，盡量保留較少的固定液，一般只保留0.5～1 mL，以提高細(xì)胞密度。最后滴片時(shí)要控制好高度，高度太低細(xì)胞分散不夠，染色體容易重疊，高度過高增加操作難度，造成細(xì)胞損失，導(dǎo)致染色體過于分散，斷裂，丟失。根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，0.8～1.0 cm的高度就能夠保證液滴擴(kuò)散良好，染色體分散均勻。如果細(xì)胞數(shù)量太少，可以提前在載玻片背面畫圈，滴片時(shí)將細(xì)胞滴在圈內(nèi)，能夠增加圈內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量，便于鏡檢觀察。

7 結(jié)語

染色體制備技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)的一項(xiàng)核心基本技術(shù)，制備過程步驟多，耗時(shí)長，影響因素多，成功率低。因此，除了選擇合適的細(xì)胞材料進(jìn)行中期誘導(dǎo)，還需要控制好每一個(gè)操作環(huán)節(jié)，消除干擾因素，才能獲得理想的中期分裂相染色體。

[1]唐慕湘,張興華,陳家強(qiáng),等.小鼠染色體制備方法初探[J].解剖學(xué)研究,2011,33(2):160.

[2]牛新華,鄭白玉.在小鼠骨髓細(xì)胞染色體制備實(shí)驗(yàn)中增加中期分裂相的方法[J].生物學(xué)通報(bào),1999(1):33.

[3]譚軍,楊泗溥,單玉秀.睪丸染色體制片方法幾點(diǎn)改進(jìn)與體會(huì)[J].癌變 畸變 突變,2003,15(2):120-121.