miR?345抑制人胰腺癌細胞的增殖能力研究*

楊 琴，王 杰，呂沐瀚，唐世孝△（.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川瀘州646000；.內(nèi)江市第一人民醫(yī)院肝膽胰外科，四川64000）

胰腺癌是消化道最具惡性的腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，在腫瘤相關致死性疾病中，胰腺癌已位居第4位[1]。近年來，胰腺癌的治療方式不斷得到發(fā)展，但是胰腺癌患者仍然保持極低的生存率，其5年生存率僅為8%[1-2]。目前，治療胰腺癌的主要手段是行手術治療，然而患者被診斷為胰腺癌時往往錯過了最佳手術時機，預后極差[3]。導致這一不良結(jié)局的主要原因之一是胰腺的解剖位置較深。一方面，常規(guī)檢查早期難以診斷；另一方面，早期臨床癥狀不顯著、腫瘤早期易轉(zhuǎn)移、對化療藥物不敏感，也是導致胰腺癌早期不易被診治的原因[4]。因此，尋找一個特異性強、敏感性高的生物靶點顯得尤為重要。

近年來有研究表明，miRNA作為獨立生物靶點在各種腫瘤中已被證實與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[5]。miRNA是一類非編碼的微小RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平與靶mRNA結(jié)合，使其降解并抑制基因的表達，從而參與調(diào)控細胞一系列生物行為[6]。有研究報道，miR-345在小細胞肺癌、前列腺癌及肝癌細胞中低表達，過表達miR-345能抑制上述腫瘤生物學性狀的改變，抑制腫瘤生長[7-9]。然而，針對胰腺癌的研究中，miR-345的相關報道還較少。本文重點探討miR-345在胰腺癌細胞中對腫瘤生物學特性增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和制劑 本實驗所選人胰腺癌細胞株分別為 AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2、SW1990 及人正常胰腺導管上皮細胞株HPDE，均購自美國ATCC細胞庫，細胞培養(yǎng)基1640、DMEM、胎牛血清均購自美國Gibco公司，miR-345及U6引物由廣州銳博生物科技有限公司負責設計及包裝，慢病毒載體（lv-miR-345-U）購自上海吉凱公司，細胞計數(shù)Kit-8（CCK-8）試劑盒購自日本同仁化學研究所，Bcl-2抗體購自美國Abcam公司。

1.1.2 動物 所選擇的免疫缺陷小鼠均為雌性，年齡4周齡，體重14～15 g，均購自北京華阜康公司。

1.1.3 組織標本 10對人胰腺癌組織及對應癌旁組織標本由西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2016年1—12月術后收集，并由病理確診為胰腺癌，置于-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細胞株PANC-1和MIA PaCa-2，含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細胞株HPDE、AsPC-1、BxPC-3、SW1990，上述細胞均放置于 37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 人胰腺癌組織和對應癌旁組織中及各胰腺癌細胞中miR-345的表達 根據(jù)總RNA抽提試劑（Trizol）說明書分別提取人胰腺癌組織和對應癌旁組織及不同種類細胞株中的總RNA，將相對吸光度在1.8～2.0（A260/A280）的樣本用于該實驗。將各樣本以U6為內(nèi)參，分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中逆轉(zhuǎn)錄反應體系為25 μL，反應條件為 70℃ 10 min，42℃ 50 min，70℃ 10 min，4℃保存。再將逆轉(zhuǎn)錄后的各樣本以U6作為內(nèi)參，分別擴增目的片段，其中實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反應體系為 25 μL，反應條件為 95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55℃30 s，70℃30 s，共45個循環(huán)。最后miR-345的表達量將采用相對定量法（RQ）來表示。

1.2.3 miR-345慢病毒感染及效率檢測 根據(jù)qRTPCR檢測結(jié)果選取2株胰腺癌細胞系，待這2株細胞系貼壁生長融合至70%～80%時，將原瓶貼壁細胞用0.05%胰蛋白酶消化至新瓶進行傳代培養(yǎng)，根據(jù)各細胞感染復數(shù)（MOI）值加入慢病毒。本實驗分為2組：過表達組（lv-miR-345-U組）、陰性對照組[空載慢病毒載法（lv-NC）組]，培養(yǎng)1周后采用qRT-PCR檢測感染效率。

1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞活力 分別將2株細胞系的細胞密度調(diào)整為1×105mL-1，接種到96孔板中，每孔約加入細胞懸液100 μL，設置復孔5個，待其貼壁后分別于 0、24、48、72、96 h 加入含 10%CCK-8 的培養(yǎng)液，加入培養(yǎng)液后3 h測定每孔在波長為450 nm時的吸光度。

1.2.5 平板克隆實驗檢測集落形成能力 分別收集處于對數(shù)生長期的2株細胞，細胞懸液密度調(diào)整為1×103mL-1，種植約2×103mL-1細胞到6孔板中，放置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，統(tǒng)計每孔克隆形成數(shù)量。

1.2.6 裸鼠皮下成瘤模型檢測體內(nèi)成瘤能力 將14只裸鼠隨機分至lv-NC組和lv-miR-345-U組中，每組7只，將處于對數(shù)生長期穩(wěn)定表達的lv-NC組和lv-miR-345-U組細胞進行收集，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）重懸后與等量Matrigel基質(zhì)膠混合，將混合液密度調(diào)整為1×107mL-1，皮下注射200 μL混合液于每只裸鼠的右后腿部。2組在相同條件下飼養(yǎng)8周，8周后采用頸部脫臼法處死裸鼠，將裸鼠體內(nèi)瘤體取出，測定腫瘤體積（mm3）。

1.2.7 Ki-67在裸鼠腫瘤中的表達 裸鼠體內(nèi)腫瘤取出后用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅（HE）染色；將Ki-67一抗按1∶400稀釋后染色。每組腫瘤切片隨機選取5張，每張切片隨機選取3個視野，統(tǒng)計并拍照。

1.2.8 蛋白質(zhì)免疫印跡（western blotting） 采用targetscan等生物信息網(wǎng)站預測miR-345的作用靶點，選取評分最高的潛在靶點，在前期工作中作者已選出Bcl-2可能是miR-345的潛在靶點，采用BCA法提取總蛋白，按50 μg上樣量計算出上樣體積，制作合適濃度的凝膠并進行電泳，孵育 Bcl-2（1∶500）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）一抗（1∶1 000），4℃搖床過夜，加入二抗室溫孵育2 h后采用辣根過氧化物酶底物（ECL電化學發(fā)光試劑）曝光。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析、整理，計量資料以表示，2組間分析采用t檢驗，各組間差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

圖1 miR-345在胰腺癌組織及細胞中的表達

圖2 miR-345在體外對胰腺癌細胞增殖能力的影響

2.1 miR-345胰腺癌組織及細胞中的表達 10對胰腺癌配對組織中，miR-345在胰腺癌組織的表達量（1.13±0.21）明顯低于對應癌旁組織中的表達量（4.53±0.68），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1A。5株胰腺癌細胞miR-345表達量與HPDE相比，均為低表達，其中AsPC-1、BxPC-3、MIAPaCa-2、PANC-1、SW1990細胞株中miR-345的相對表達量分別為 0.34±0.05、0.71±0.06、0.49±0.09、0.31±0.01、0.26±0.06，均顯著低于 HPDE 細胞株（1.08±0.13），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1B。

2.2 miR-345慢病毒在胰腺癌中的感染效率 選取表達差異明顯的PANC-1和SW1990作為實驗所用細胞系，并感染慢病毒。2株細胞感染慢病毒后lv-miR-345-U組miR-345表達量均較lv-NC組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2A、2B。

圖3 miR-345在體內(nèi)對胰腺癌細胞增殖能力的影響

2.3 miR-345對胰腺癌細胞增殖活力的影響 培養(yǎng)PANC-1和SW1990細胞96 h后，吸光度值lv-miR-345-U組較lv-NC組均明顯降低；其中PANC-1細胞系lvmiR-345-U組吸光度值為1.25±0.05，lv-NC組為2.22±0.15；SW1990細胞系lv-miR-345-U組吸光度值為1.49±0.07，lv-NC組為2.25±0.12，2株細胞系不同組別之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2C、2D。

2.4 miR-345對胰腺癌細胞集落形成的影響 2株細胞系lv-miR-345-U組較lv-NC組集落形成數(shù)量均明顯減少，其中l(wèi)v-miR-345-U組集落形成數(shù)量PANC-1為86.67±14.62，SW1990 為 314.70±16.76；lv-NC 組集落形成數(shù)量 PANC-1為 417.00±19.97，SW1990為 814.00±34.12；2株細胞系比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2E、2F。

2.5 miR-345對胰腺癌細胞體內(nèi)成瘤的影響 取出的腫瘤體積lv-miR-345-U組較lv-NC組明顯變小，其中l(wèi)v-miR-345-U 組（82.71±16.25）mm3，lv-NC 組（223.60±23.60）mm3，2 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3A、3B。

2.6 miR-345對Ki-67表達的影響 lv-miR-345-U組Ki67表達量明顯低于lv-NC組，其中Ki-67的相對表達量 lv-miR-345-U 組為 0.15±0.02，lv-NC 組為 0.52±0.05，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3C、3D。

2.7 miR-345對Bcl-2蛋白表達的影響 Westernboltting結(jié)果顯示，lv-miR-345-U組Bcl-2的蛋白表達水平較lv-NC組明顯下調(diào)。見圖4。

圖4 miR-345對Bcl-2蛋白水平的影響

3 討 論

近年來，胰腺癌患病率逐年上升，預計到2030年，在致死性的腫瘤相關疾病中，胰腺癌將上升至第2位[10]。miRNA是一組由19～22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小RNA，其能通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達[11]。miRNA作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，參與機體的各種生理功能，如胚胎發(fā)育、細胞增殖及細胞凋亡等。miRNA的異常表達在疾病發(fā)生、發(fā)展包括腫瘤形成過程中起到了重要作用[11]。

國內(nèi)外大量研究表明，miR-345在肝癌細胞中發(fā)揮著重要作用，miR-345在肝癌組織及肝癌細胞系中低表達，miR-345表達量與肝癌患者預后相關，表達量越低，患者預后越差；另一方面，在體外實驗中，過表達miR-345可通過直接作用于靶蛋白YAP1，使后者表達受到抑制（YAP1是一種“癌蛋白”，負責編碼hippo信號通路下游中的關鍵蛋白），最終導致肝癌MHCC-97H細胞系遷移能力增強[9]。也有研究報道，miR-345能通過直接靶向作用于IRF1調(diào)控的mTOR/STAT3/AKT信號通路，最終導致肝癌HCCLM3細胞系生物學特性減弱[12]。CHEN等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-345在前列腺癌患者中低表達，并通過動物實驗和體外實驗證實miR-345能抑制前列腺癌細胞的增殖，其潛在機制可能是miR-345直接作用靶蛋白Smad1，使其表達下降，異常表達的Smad1可導致腫瘤細胞的增殖及遷移能力增強。TANG等[14]研究指出，miR-345在結(jié)腸腫瘤細胞中低表達，低表達的miR-345往往與惡性的病理類型及早期的淋巴轉(zhuǎn)移相關，但miR-345對甲基化處理敏感，人為的甲基化處理可使miR-345表達水平升高，過表達miR-345又足以抑制結(jié)腸腫瘤細胞的增殖。然而，胰腺癌與miR-345的相關報道還較少，所以，本研究的重點從體外實驗和動物實驗2個方面探討了miR-345對胰腺癌細胞增殖的影響。首先，作者檢測了miR-345在胰腺癌組織及細胞系中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-345低表達，然后構(gòu)建了miR-345過表達和陰性對照組的慢病毒載體，并分別成功感染了2株胰腺癌細胞系，在體外實驗方面作者采用CCK-8、平板克隆分別檢測了miR-345對胰腺癌細胞增殖活力及集落形成能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-345過表達能抑制胰腺癌細胞的體外增殖；最后建立了裸鼠皮下成瘤模型，并將成瘤后的瘤體包埋切片進行免疫組織化學實驗，結(jié)果顯示miR-345能抑制胰腺癌細胞的體內(nèi)成瘤及抑制腫瘤增殖指標Ki-67的表達；綜合體內(nèi)、體外實驗結(jié)果可以得出結(jié)論，miR-345能抑制胰腺癌細胞的增殖能力，為作者進一步研究該抑制作用的深入機制提供了一定的理論基礎。通過3種不同的生物信息預測網(wǎng)站，如Target scan、microRNA、org等預測了miR-345可能的潛在靶點，發(fā)現(xiàn)Bcl-2可能為miR-345在胰腺癌中直接作用的靶點。Bcl-2是調(diào)控細胞凋亡的關鍵蛋白，該蛋白的功能之一是抑制細胞的凋亡。有研究表明，過表達Bcl-2能減少阿帕替尼導致的骨肉瘤細胞的自噬及凋亡[15]。在胰腺癌細胞中，抑制miR-1180的表達能顯著抑制胰腺癌細胞的增殖，其潛在的機制是下調(diào)miR-1180，抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活及下游Bcl-2蛋白的表達，最終抑制胰腺癌細胞的增殖[16]。因此，過表達miR-345在胰腺癌中可抑制腫瘤細胞的增殖，其潛在機制可能是引起下游靶蛋白Bcl-2的表達下調(diào)，進而加快腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖。本課題組的前期研究已證實miR-345能抑制胰腺癌細胞的增殖，并采用western boltting檢測了miR-345能促進Bcl-2的表達下調(diào)，進一步采用雙熒光素酶報告分析實驗驗證了Bcl-2是否為miR-345的直接作用靶點。另一方面，是否存在其他關鍵靶蛋白及是否激活某些通路（如ERK-MEK信號通路，瀑布式激活下游靶蛋白，最終導致ERK磷酸化激活，一部分直接入核調(diào)控增殖相關轉(zhuǎn)錄因子的表達上調(diào)，促進轉(zhuǎn)錄，一部分調(diào)控細胞周期表達，促進G1期向S期轉(zhuǎn)變，促進細胞的增殖加快，或協(xié)同其他通路共同調(diào)控細胞增殖），其潛在機制還需進一步研究。

綜上所述，作者采用動物實驗、體外實驗分別探討了miR-345對胰腺癌細胞增殖的影響。結(jié)果提示miR-345能抑制胰腺癌細胞的增殖，為進一步探討其潛在機制打下理論基礎，miR-345有望成為胰腺癌新型靶向治療藥物的生物靶點。

[1]SIEGEL RL，MILLER KD，JEMAL A.Cancer statistics，2016[J].CA Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

[2]HANAHAN D，WEINBERG RA.Hallmarks of cancer：the next Generation[J].Cell，2011，144（5）：646-674.

[3]HABROOK CJ，LYSSIOTIS CA.Employing metabolism to improve the diagnosis and treatment of pancreatic cancer[J].Cancer Cell，2017，31（1）：5-19.

[4]BAILEY P，CHANG DK，NONES K，et al.Genomic analyses identify molecularsubtypesofpancreaticcancer[J].Nature，2016，531（7592）：47-52.

[5]CHITKARA D，MITTAL A，MAHATO RI.miRNAs in pancreatic cancer：therapeutic potential，delivery challenges and strategies[J].Adv Drug Deliv Rev，2015，81（10）：34-52.

[6]KARAMITOPOULOU E，HAEMMIG S，BAUMGARTNER UA，et al.MicroRNA dysregulation in the tumor microenvironment influences the phenotype of pancreatic cancer[J].Modern Pathology，2017，30（8）：1116-1125.

[7]RACHAGANI S，MACHA MA，MENNING MS，et al.Changes in microRNA（miRNA）expression during pancreatic cancer development andprogressioninageneticallyengineeredKras（G12D），Pdx1-Cremouse（KC）model[J].Oncotarget，2015，37（6）：40295-40309.

[8]WANG SY，SHIBOSKI S，BELAIR CD，et al.miR-19，miR-345，miR-519c-5p serum levels predict adverse pathology in prostate cancer patients eligible for active surveillance[J].PLoS One，2014，9（6）：e98597.

[9]ZHANG H，LIU H，BI H.MicroRNA-345 inhibits hepatocellular carcinomametastasisbyinhibitingYAP1[J].OncolRep，2017，38（2）：843-849.

[10]ADAMSKA A，DOMENICHINI A，F(xiàn)ALASCA M.Pancreatic ductal adenocarcinoma：current and evolving therapies[J].Int J Mol Sci，2017，18（7）：1338.

[11]HYDBRING P，WANG YA，F(xiàn)ASSL A，et al.Cell-cycle-targeting microRNAs as therapeutic tools against refractory cancers[J].Cancer Cell，2017，31（4）：576-590.

[12]YU M，XUE H，WANG Y，et al.MiR-345 inhibits tumor metastasis and EMT by targeting IRF1-mediated mTOR/STAT3/AKT pathway in hepatocellular carcinoma[J].Int J Oncol，2017，50（3）：975-983.

[13]CHEN QG，ZHOU W，HAN T，et al.MiR-345 suppresses proliferation，migration and invasion by targeting Smad1 in human prostate cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，2016，142（1）：213-224.

[14]TANG J，WANG J，DU WN，et al.MicroRNA 345，a methylation-sensitive microRNA is involved in cell proliferation and invasion in human colorectal cancer[J].Carcinogenesis，2011，32（8）：1207-1215.

[15]LIU K，REN T，HUANG Y，et al.Apatinib promotes autophagy and apoptosis through VEGFR2/STAT3/BCL-2 signaling in osteosarcoma[J].Cell Death Dis，2017，8（8）：e3015.

[16]GU L，ZHANG J，SHI M，et al.The effects of miRNA-1180 on suppression of pancreatic cancer[J].Am J Transl Res，2017，9（6）：2798-2806.