燈盞花素改善動脈粥樣硬化損傷的實驗研究*

武迎磊 趙 天 李 明

（1.河北省邢臺市第三醫(yī)院，河北 邢臺 054000；2.河北省滄州市食品藥品檢驗所，河北 滄州061000）

動脈粥樣硬化是多種心腦血管系統(tǒng)疾病的病理基礎(chǔ)，其中氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)是其重要的病理機制［1-2］。燈盞花素是一種具有抗炎、抗氧化、改善血液循環(huán)等多種生物學(xué)活性的黃酮類化合物［3-5］，但燈盞花素是否能夠通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)而對動脈粥樣硬化起到一定的改善作用尚未見文獻報道，本實驗通過建立大鼠動脈粥樣硬化模型并同步給予燈盞花素進行干預(yù)治療，研究燈盞花素對動脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響并初步探討其機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用SD大鼠（清潔級，雄性，鼠齡6周齡，體質(zhì)量180~220 g）購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。

1.2 藥物與試劑 燈盞花素片購自廣州彼迪藥業(yè)有限公司（規(guī)格：20 mg/片，生產(chǎn)批號：20150917）；辛伐他汀片（SV）購自北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司；氧化應(yīng)激監(jiān)測指標試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；H&E試劑盒及炎癥細胞因子檢測試劑盒購自北京博奧森科技有限公司。

1.3 模型制備 參照周永剛等［6］報道的實驗方法制備動脈粥樣硬化大鼠模型：除正常對照組外，其余各組大鼠均通過喂養(yǎng)高脂飼料（3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料）結(jié)合腹腔注射維生素D3［給予飼料前一次性腹腔注射維生素D3（60萬U/kg）］的方法建立大鼠動脈粥樣硬化模型，共12周。主動脈大體解剖狀況見圖1。

1.4 分組與給藥 選取80只模型大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為模型組、 燈盞花素 6、12、24 mg/（kg·d）組和辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組，各組均 16 只，造模過程中各治療組同步灌胃給藥12周；另取同齡SD大鼠16只設(shè)為正常對照組，同步給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.5 標本采集與檢測 1）HE染色法觀察主動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)改變并進行病變分級。麻醉后剝?nèi)∪L主動脈，經(jīng)4%多聚甲醛液中固定、脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色后，通過顯微鏡觀察主動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；主動脈病變標準［7］為0級：結(jié)構(gòu)正常；1級：內(nèi)膜有少量泡沫細胞積聚，無明顯的凸起斑塊；2級：內(nèi)膜可見大量泡沫細胞積聚，有明顯的粥樣斑塊，部分斑塊融合成片；3級：內(nèi)膜表面幾乎全被粥樣斑塊覆蓋，斑塊內(nèi)可見組織壞死、鈣化，斑塊底部肌層萎縮變薄。2）比色法測定血清中抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）含量。腹主動脈取血并離心取血清，采用比色法，通過紫外可見分光光度計測定各組大鼠血清中抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、過氧化氫酶（CAT）］活性和 MDA、ROS 含量。 3）血漿中炎癥細胞因子含量測定。經(jīng)腹主動脈取血并按照ELISA試劑盒說明書進行處理，采用比色法，通過酶標儀測定各組大鼠血漿中炎癥細胞因子 ［C反應(yīng)蛋白（CRP）、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、 白細胞介素 1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）］含量水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計處理。計量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA檢驗，主動脈病變分級采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造模過程大鼠生存狀態(tài)及主動脈狀況 見圖1。正常組大鼠生存狀態(tài)良好、主動脈未見異常；而模型組大鼠呈現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)脫落等狀態(tài)，主動脈呈現(xiàn)血管萎縮、血管壁增厚、多處鈣化等病理狀態(tài)。

圖1 主動脈大體解剖圖片

2.2 各組大鼠主動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及病變分級 見圖2，表1。正常對照組大鼠主動脈組織及細胞均未見異常，而模型組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞明顯受損、出現(xiàn)慢性炎癥病變、泡沫細胞形成并伴有粥樣硬化斑塊等明顯的病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。與模型組比較發(fā)現(xiàn)，燈盞花素 6、12、24 mg/（kg·d）組和辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）大鼠動脈粥樣硬化病變程度呈不同程度減輕，以燈盞花素24 mg/（kg·d）組效果最為顯著。評價主動脈病變分級：模型組大鼠主動脈病變2級及以上共14例（87.50%），其病變分級較正常對照組顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，燈盞花素 6、12 mg/（kg·d）組主動脈病變分級較模型組無顯著差異（P＞0.05），燈盞花素 24 mg/（kg·d）組和辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組主動脈病變分級顯著降低 （P＜0.01）；與辛伐他汀1.8 mg/（kg·d）組比較，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組主動脈病變分級無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠主動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（HE染色，400倍）

表1 各組大鼠主動脈病變分級結(jié)果比較

2.3 各組大鼠血清抗氧化酶活性水平比較 見表2。與正常對照組比較，模型組大鼠血清抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，燈盞花素 12、24 mg/（kg·d）組大鼠血清 SOD、CAT 活性（P＜0.05 或 P＜0.01）顯著升高，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05）；燈盞花素6 mg/（kg·d）組和辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組 SOD、GSH-Px、CAT活性與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）；與辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組比較，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組SOD、CAT 活性顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01），GSH-Px活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清中抗氧化酶活性水平比較（U/mL，±s）

表2 各組大鼠血清中抗氧化酶活性水平比較（U/mL，±s）

組別 n C A T正常對照組 1 6 1 4.8 2±1.8 8模型組 1 6 8.6 5±1.4 9**燈盞花素 6 m g/（k g·d）組 1 6 9.3 7±1.7 6 S O D G S H-P x 4 2 1.6 9±3 4.2 1 9 2 8.5 3±5 7.5 8 2 5 1.3 0±2 6.0 3** 6 7 9.0 4±4 5.1 7**2 7 3.8 6±2 7.6 2 7 4 1.2 9±5 1.9 8燈盞花素 1 2 m g/（k g·d）組 1 6 1 1.9 2±2.1 7**3 1 8.5 1±3 0.7 5** 7 7 3.8 4±5 9.1 3燈盞花素 2 4 m g/（k g·d）組 1 6 3 6 1.4 3±3 4.6 8△△▲ 8 1 5.3 0±5 7.4 0△ 1 3.0 2±2.3 4△▲▲辛伐他汀 1.8 m g/（k g·d）組 1 6 2 8 3.0 6±3 1.2 2 7 6 3.4 8±4 9.1 5 9.8 2±1.7 3

2.4 各組大鼠血清MDA、ROS含量比較 見表3。與正常對照組比較，模型組大鼠血清MDA、ROS含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組，燈盞花素 12、24 mg/（kg·d）組和辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組大鼠血清 MDA、ROS含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），燈盞花素 6 mg/（kg·d）組MDA、ROS含量較模型組無顯著差異 （P＞0.05）；與辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組比較，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組 MDA 含量顯著降低（P＜0.05），ROS 含量無顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠大鼠血清MDA、ROS含量比較（±s）

表3 各組大鼠大鼠血清MDA、ROS含量比較（±s）

組 別 n正常對照組 1 6模型組 1 6燈盞花素 6 m g/（k g·d）組 1 6 M D A（m m o l/L） R O S（U/m L）9.5 7±0.9 2 2 0 7.4 2±2 1.9 4 4 8.0 6±6.1 8** 3 8 6.3 4±3 5.1 5**4 3.7 1±5.5 2 3 5 1.9 0±3 2.9 8燈盞花素 1 2 m g/（k g·d）組 1 6 2 9.7 6±4.6 1△△ 2 8 4.7 1±2 8.3 7△燈盞花素 2 4 m g/（k g·d）組 1 6 2 5.1 3±4.1 7△△▲ 2 4 0.0 8±2 1.9 2△△辛伐他汀 1.8 m g/（k g·d）組 1 6 3 4.6 2±4.8 4△ 2 8 7.5 4±3 0.7 8△

2.5 各組大鼠血漿中炎癥細胞因子含量比較 見表4~表5。與正常對照組比較，模型組大鼠血漿中炎癥細胞因子 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量顯著升高 （P＜0.01），炎癥細胞因子 IL-10含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較， 燈盞花素 12、24 mg/（kg·d） 組 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量顯著降低 （P＜0.05 或 P＜0.01），燈盞花素 24 mg/（kg·d）組 IL-10 含量顯著升高（P＜0.01）；燈盞花素 6 mg/（kg·d）組 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 含量較模型組均無顯著差異（P＞0.05）；辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組 TNF-α 含量較模型組顯著降低 （P＜0.05），CRP、IL-1β、IL-6、IL-10 含量無顯著差異（P＞0.05）；與辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組比較，燈盞花素 24 mg/（kg·d） 組 CRP、IL-6 含量顯著降低且IL-10 顯著升高（P＜0.05），TNF-α、IL-1β 含量無顯著差異（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血漿中CRP、TNF-α含量比較（±s）

表4 各組大鼠血漿中CRP、TNF-α含量比較（±s）

組 別 n正常對照組 1 6模型組 1 6燈盞花素 6 m g/（k g·d）組 1 6 C R P（m g/L） T N F-α（μ g/L）4.6 2±1.0 8 1.5 2±0.4 1 1 8.7 5±3.9 0** 3.0 2±0.7 2**1 7.6 2±3.8 1 2.5 8±0.6 2燈盞花素 1 2 m g/（k g·d）組 1 6 1 4.0 2±3.1 6△ 2.3 3±0.7 9△燈盞花素 2 4 m g/（k g·d）組 1 6 1 1.4 9±2.5 8△△▲ 1.9 2±0.4 8△辛伐他汀 1.8 m g/（k g·d）組 1 6 1 7.2 6±4.0 3 2.0 3±0.4 1△

表5 各組大鼠血漿中 IL-1β、IL-6、IL-10 含量比較（pg/mL，±s）

表5 各組大鼠血漿中 IL-1β、IL-6、IL-10 含量比較（pg/mL，±s）

組別 n正常對照組 1 6模型組 1 6燈盞花素 6 m g/（k g·d）組 1 6 I L-6 I L-1 0 5 6.6±1 0.9 6 4.6 8±5.0 8 1 3 8.4±3 4.1** 2 5.3 4±3.7 5**1 2 7.9±3 0.8 2 7.1 3±4.2 4燈盞花素 1 2 m g/（k g·d）組 1 6 1 3 0.8±2 7.9△ 1 0 5.0±2 8.7△ 3 0.8 2±4.8 6燈盞花素 2 4 m g/（k g·d）組 1 6 1 2 3.5±2 5.3△ 8 9.1±2 4.9△△▲ 3 8.4 7±5.3 2△△▲辛伐他汀 1.8 m g/（k g·d）組 1 6 1 4 6.7±2 8.9 1 2 2.3±3 1.5 2 9.0 3±3.6 8 I L-1 β 1 0 7.5±1 7.8 1 8 0.2±3 1.9**1 6 3.6±3 2.1

3 討 論

隨著病理生理學(xué)研究的深入，有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要病理機制［8-9］。 Considine MJ 等［10］研究發(fā)現(xiàn) ROS 生成的活性氧和NO將破壞血管壁的光滑性，形成斑塊，斑塊破裂形成血栓。生理狀態(tài)下ROS的產(chǎn)生與還原清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，其中體內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT在維持ROS平衡中發(fā)揮著重要的作用［11-12］；抗氧化酶活性低下將導(dǎo)致ROS清除能力下降，進而ROS蓄積而引發(fā)動脈血管的過氧化損傷；此外，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映動脈血管氧化應(yīng)激損傷程度。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)燈盞花素12~24 mg/（kg·d）干預(yù)治療能夠明顯改善動脈粥樣硬化大鼠SOD、GSH-Px、CAT活性并降低MDA、ROS含量，提示燈盞花素具有抑制動脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激損傷的作用。并且，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組 SOD、CAT 活性顯著高于辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d） 組且 MDA、ROS 含量顯著低于辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組（P＜0.05 或 P＜0.01），提示燈盞花素抗氧化作用優(yōu)于辛伐他汀。

炎癥反應(yīng)可以通過多種途徑促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［13］，Ovsepyan VA 等［14-15］研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化斑塊病灶將促進巨噬細胞促炎癥細胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6 大量釋放、 同時抑制抑炎癥因子IL-10的分泌，進而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)平滑肌細胞的凋亡、促進動脈粥樣硬化發(fā)展。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花素 24 mg/（kg·d）組 CRP、IL-6 含量顯著低于辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組，且 IL-10顯著高于辛伐他汀 1.8 mg/（kg·d）組（P＜0.05），提示燈盞花素抑制炎癥反應(yīng)作用優(yōu)于辛伐他汀。

總之，燈盞花素能夠通過抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)而對動脈粥樣硬化起到一定改善作用，并且燈盞花素對動脈粥樣硬化的改善作用優(yōu)于辛伐他汀。

［1］ Landmesser U，Spiekermann S，Dikalov S，et al.Vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in patients with chronic heart failure：role of xanthine-oxidase and extracellular superoxide dismutase［J］.Circulation，2002，106（24）：3073-3078.

［2］ Qiang G，Wenzhai C，Huan Z，et al.Effect of Sancaijiangtang on plasma nitric oxide and endothelin-1 levels in patients with type 2 diabetes mellitus and vascular dementia：a single-blind randomized controlled trial［J］.J Tradit Chin Med，2015，35（4）：375-380.

［3］ 丁寧.燈盞花素注射液對痛風(fēng)患者抗氧化能力的影響研究［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2016，10（10）：150-151.

［4］ 李軍，吳立友，王朝陽.燈盞花素注射液對2型糖尿病早期腎病患者相關(guān)炎癥因子的影響［J］.中藥藥理與臨床，2011，27（3）：110-112.

［5］ 金桂蘭，覃慧林，石孟瓊，等.燈盞花素對小鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用及與腦組織P-糖蛋白表達研究［J］.中藥藥理與臨床，2015，31（1）：76-79.

［6］ 周永剛，藍曉紅，李祥，等.動脈粥樣硬化大鼠實驗?zāi)Ｐ偷慕⑴c評價［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2011，27（5）：399-403.

［7］ 王偉，楊濱，王嵐，等.丹參山楂藥對對大鼠動脈粥樣硬化的影響［J］.中國中藥雜志，2011，36（6）：784-789.

［8］ 王爽，陳瀟，孟國梁，等.靈芝多糖對動脈粥樣硬化大鼠氧化應(yīng)激的影響［J］.中藥藥理與臨床，2011，27（6）：38-42.

［9］ 沈建飛，盛一梁，徐丹，等.降脂丸對動脈粥樣硬化大鼠模型炎癥因子表達的影響［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（19）：1600-1603.

［10］ Considine MJ，Sandalio LM，F(xiàn)oyer CH.Unravelling how plants benefit from ROS and NO reactions，while resisting oxidative stress［J］.Ann Bot，2015，116（4）：469-473.

［11］ Lartigue A，Burlat B，Coutard B，et al.The megavirus chilensis Cu，Zn-superoxide dismutase： the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme［J］.J Virol，2014，2588（14）：254-261.

［12］ Li X，Zhao L，Yue L，et al.Evidence for the protective effects of curcumin against oxyhemoglobin-induced injury in rat cortical neurons［J］.Brain Res Bull，2016，120：34-40.

［13］ Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340（2）：115-126.

［14］ Ovsepyan VA， Gabdulkhakova AKh，Shubenkiva AA，et al.Role of interleukin-10 gene promoter region polymorphism in the development of chronic lymphoid leukemia［J］.Bull Exp Biol Med，2015，160（2）：275-277.

［15］張安邦，高杰，李令根，等．相關(guān)炎癥因子與動脈粥樣硬化的關(guān)系［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2014，20（5）：563-566．