冠心病患者固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1炎性體相關(guān)性研究

徐健強(qiáng)，王燕，盤艷君，喻思揚(yáng)，曾高峰，趙國軍

冠心病發(fā)病主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）。AS發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，與脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)激活及內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)等多因素相關(guān)[1-3]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1（NLRP1）炎性體由NLRP1、半胱天冬酶（Caspase）-1及凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）三者組成。炎性體相當(dāng)于一個(gè)活化Caspase-1的支架，活化的Caspase-1能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）及IL-18成熟[2,4]，參與多種炎癥性疾病的病理進(jìn)程[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）后，人急性單核細(xì)胞白血病（THP-1）巨噬細(xì)胞中NLRP1、IL-1β和IL-18表達(dá)均顯著下降[6,7]，提示SREBP-1可能通過調(diào)控NLRP1炎性體參與冠心病進(jìn)程。本研究觀察冠心病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）SREBP-1與NLRP1炎性體的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討二者之間的相關(guān)性。

1　資料與方法

對象：選取2015-07至2016-01體檢中心20名健康志愿者（正常對照組）。選取同時(shí)間段內(nèi)在本院行冠狀動(dòng)脈造影確診冠心病患者104例（有1支及以上主要血管狹窄≥50%），其中穩(wěn)定性心絞痛49例（SAP組）和急性冠狀動(dòng)脈綜合征55例（ACS組），急性冠狀動(dòng)脈綜合征包含不穩(wěn)定型心絞痛（初發(fā)心絞痛、靜息型心絞痛和勞力惡化型心絞痛）和急性心肌梗死。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝功能異常；出現(xiàn)橫紋肌溶解；合并腫瘤；合并腎功能不全且失代償（血清肌酐濃度 ＞ 165 μmol/L，或血清肌酐清除率 ＜ 30 ml/min）；合并妊娠；嚴(yán)重心功能不全[紐約心臟協(xié)會(huì)（NYHA）心功能分級 ≥ 3級，或左心室射血分?jǐn)?shù) ＜ 35%）]；1個(gè)月內(nèi)心肺復(fù)蘇術(shù)病史；近3個(gè)月有重大外傷、手術(shù)史；1個(gè)月內(nèi)使用他汀、抗生素、阿司匹林等影響炎性因子表達(dá)者；明顯影響血流動(dòng)力學(xué)的二尖瓣、主動(dòng)脈瓣狹窄或關(guān)閉不全；合并急、慢性感染者；持續(xù)或頻發(fā)室性心動(dòng)過速，心室顫動(dòng)患者。

方法：采血前禁煙、酒、茶、咖啡等24小時(shí)以上。次日清晨使用25 IU/ml肝素抗凝管，空腹肘靜脈采血10 ml， 2小時(shí)內(nèi)處理血樣，分離血漿置于-20℃冰箱待檢測，密度梯度法分離PBMCs，分置于兩個(gè)無菌干燥離心管中，用于提取RNA及蛋白。血漿IL-1β、IL-18和高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。SREBP-1、NLRP1和Caspase-1的mRNA和蛋白分別采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）和蛋白免疫印跡分析（WB），引物序列：人NLRP1：上游5’-TCT GGT TCA GGG ATG CTG GA-3’， 下 游 5’-GCA CTA GTA TCT CCT GGC GTC-3’， 人 Caspase-1：上 游5’-ACA TCC CAC AAT GGG CTC TG-3’， 下游 5’-TTC ACT TCC TGC CCA CCG AC-3’， 人 SREBP-1：上游 5’-TGA CCG ACA TCG AAG GTG AA-3’，下游 5’- AAA GTG CAA TCC ATG GCT CC -3’。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組組間數(shù)據(jù)分析采用Student's t 檢驗(yàn)，三組或多組組間的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析；相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

三組臨床基線資料比較：SAP組和ACS組吸煙史、收縮壓、舒張壓、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯、總膽固醇與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，表1）。

表1　三組臨床基線資料比較（±s）

表1　三組臨床基線資料比較（±s）

注：SAP：穩(wěn)定性心絞痛；ACS：急性冠狀動(dòng)脈綜合征；TG：甘油三脂；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；TC：總膽固醇。與正常對照組比較*P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

血漿IL-1β、IL-18和hs-CRP的濃度變化：SAP組與ACS組血漿IL-1β、IL-18及hs-CRP濃度較正常對照組顯著增高； ACS組血漿IL-1β、IL-18及hs-CRP濃度較SAP組顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表 2）。

表2　研究對象血漿炎癥因子濃度比較（±s）

表2　研究對象血漿炎癥因子濃度比較（±s）

注：SAP：穩(wěn)定性心絞痛；ACS：急性冠狀動(dòng)脈綜合征；IL:白細(xì)胞介素；hs-CRP：高敏C反應(yīng)蛋白。與正常對照組比較*P＜0.05；與SAP組比較△P＜0.05

正常對照組　20　6.65±0.73　263.71±15.00　2.29±0.41

PBMCs內(nèi)SREBP-1、NLRP1和Caspase-1的表達(dá)變化：SAP組與ACS組PBMCs內(nèi)SREBP-1、NLRP1和Caspase-1的表達(dá)水平（包括mRNA和蛋白）均較正常對照組顯著增高；且 ACS組患者PBMCs內(nèi)SREBP-1、NLRP1和Caspase-1 的表達(dá)較SAP組顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1A，圖1B）。

圖1　PBMCs內(nèi)SREBP-1、NLRP1及Caspase-1 mRNA表達(dá)（1A）及蛋白表達(dá)（1B）

SREBP-1 與 NLPR1、Caspase-1、IL-1β 和IL-18表達(dá)水平相關(guān)性：PBMCs內(nèi)SREBP-1 mRNA表達(dá)水平與 NLPR1（r=0.851，P＜0.05）、Caspase-1（r=0.874，P＜0.05）、血漿 IL-1β（r=0.891，P＜ 0.05）、血漿IL-18（r=0.664，P＜ 0.05）表達(dá)呈明顯的正相關(guān)（圖 2）。

圖2　SREBP-1與NLRP1炎性體的相關(guān)性分析

3　討論

AS是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)參與AS的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥全過程[8]。AS病變早期，血液單核細(xì)胞受調(diào)控穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)入內(nèi)皮下層，分化成為巨噬細(xì)胞[9]，吞噬修飾的氧化低密度脂蛋白膽固醇成為泡沫細(xì)胞，釋放IL-1β、IL-18等炎性因子，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)展。IL-1β與IL-18在動(dòng)脈粥樣斑塊中高度表達(dá)，可激活炎性通路增加AS斑塊不穩(wěn)定性，增大血栓事件發(fā)生概率[10，11]。本研究發(fā)現(xiàn)在冠心病患者血液中IL-1β和IL-18表達(dá)水平較正常對照組高，且ACS組比SAP組水平更高，進(jìn)一步證實(shí)了IL-1β和IL-18參與AS的發(fā)展過程。

炎性體是位于一類細(xì)胞內(nèi)的多蛋白寡聚復(fù)合體，NLRP1炎性體是Martinon等[12]在2002年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)炎性體。近年研究發(fā)現(xiàn)，NLRP1炎性體參與AS、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[13，14]。NLRP1炎性體活化后，Caspase-1裂解成熟，促進(jìn)pro-IL-1β和pro-IL-18裂解形成具有活性的IL-1β和IL-18[15]。小鼠腦梗模型中，NLRP1、IL-1β及IL-18表達(dá)均明顯升高，抑制NLRP1炎性體活化后，IL-1β和IL-18的表達(dá)下降，腦組織壞死面積減少[16]。體內(nèi)抑制小鼠骨髓炎模型Caspase-1活性，IL-1β表達(dá)水平也相應(yīng)下降[17]。在本研究中，冠心病患者PBMCs內(nèi)NLRP1炎性體表達(dá)增加，且ACS組比SAP組水平更高，這與體內(nèi)IL-1β和IL-18水平升高一致，說明NLRP1炎性可能參與了冠心病患者體內(nèi)炎癥水平的改變。

SREBPs屬于膜轉(zhuǎn)錄因子家族，其編碼基因有兩個(gè)，SREBP-1和SREBP-2基因。小鼠體內(nèi)SREBP-1還分為SREBP-1a和-1c兩種亞型。SREBP-1主要調(diào)控脂肪酸和糖代謝，SREBP-2主要參與膽固醇合成。有研究發(fā)現(xiàn)，SREBP-1可參與調(diào)控腫瘤、脂肪變性及巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答等[18，19]。SREBP-1基因敲除后，由盲腸穿孔介導(dǎo)的內(nèi)毒素休克和全身炎癥反應(yīng)受到明顯抑制，NLRP1炎性體激活受阻，IL-1β和IL-18釋放減少[20]。本課題組前期研究顯示，使用siRNA抑制THP-1巨噬細(xì)胞SREBP-1后，NLRP1、IL-18和IL-1β表達(dá)均下降，說明SREBP-1能夠激活NLRP1炎性體[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血液PBMCs內(nèi)SREBP-1與NLRP-1、Caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了SREBP-1可能通過激活NLRP1炎性體，促進(jìn)IL-18和IL-1β釋放分泌，參與AS的發(fā)生發(fā)展。

值得指出的是，本研究存在一定局限性，首先，入選對象可能受主觀因素干擾；其次，正常對照組與冠心病患者屬非同類人群，并非嚴(yán)格的病例對照研究，可能造成一定的偏倚。

AS發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，脂質(zhì)代謝與炎癥是其發(fā)生發(fā)展的重要原因，二者關(guān)系密切[21]，然而其內(nèi)在聯(lián)系尚未完全闡明。本研究不僅證實(shí)了冠心病患者SREBP-1與NLRP1炎性體表達(dá)升高，也進(jìn)一步在體內(nèi)確認(rèn)了SREBP-1表達(dá)與NLRP1炎性體呈正相關(guān)關(guān)系，為以SREBP-1和NLRP1炎性體為靶點(diǎn)防治AS等炎癥性疾病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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