益骨湯對(duì)去勢(shì)大鼠骨組織Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路的影響

林曉芳 姚新苗 李威 陳賢彪 方芳

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種與年齡相關(guān)的慢性虛弱性骨骼疾病，其特征在于骨量的丟失和骨微結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致脆性骨折的發(fā)生率增加[1]。據(jù)估計(jì)，40%的絕經(jīng)后婦女在生活中將至少經(jīng)歷一次骨質(zhì)疏松性骨折[2-3]，其中髖部骨折的發(fā)生率隨著年齡的增長(zhǎng)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)[4]。目前臨床上治療OP的藥物包括雌激素類藥物[5]、雙膦酸鹽[6]、降鈣素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑[7]、重組人甲狀旁腺激素、維生素D類似物和依普黃酮等[8]。這些藥物的作用機(jī)制多是減少骨吸收、促進(jìn)骨形成和促進(jìn)骨礦化，這僅增加了骨密度（bone mineral density，BMD），卻不能改善骨質(zhì)量與骨強(qiáng)度，因而無法有效降低骨折發(fā)生率[9]，且大多存在一些副作用[10]，限制了臨床應(yīng)用。

近年來的研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨發(fā)育中起關(guān)鍵作用，已經(jīng)成為OP治療的潛在靶點(diǎn)[9]。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路主要由細(xì)胞外因子（Wnt）、β-鏈蛋白（β-catenin）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2（Runtrelated transcription factor2，Runx2）、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osterix，OSX）組成，而 Dickkopf相關(guān)蛋白 1（Dickkopf1，DKK1）是 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的特異性抑制劑。筆者所在的研究團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事OP的相關(guān)研究，研發(fā)的益骨湯（組方為骨碎補(bǔ)、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、丹參、生地、山藥）經(jīng)臨床研究證實(shí)能顯著改善原發(fā)性O(shè)P患者的疼痛癥狀，且未觀察到明顯的副作用[11]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)能提高實(shí)驗(yàn)性O(shè)P模型大鼠的載荷及痛域[12-13]，上調(diào)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin基因的表達(dá)[14]，但益骨湯具體的作用機(jī)制尚不明確。

本研究以切除卵巢的Wistar大鼠為研究對(duì)象，測(cè)定大鼠右側(cè)股骨BMD，并檢測(cè)骨組織中Wnt/βcatenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的基因及蛋白表達(dá)量，探究益骨湯防治OP的作用機(jī)制，為益骨湯在臨床上的推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 12周齡清潔級(jí)雌性Wistar大鼠44只，體質(zhì)量（220±10）g，均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，合格證編碼：2013001806499。大鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)室設(shè)施許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng)，室溫控制在（21±1）℃，濕度63%，噪音≤55分貝，自由攝食、飲水，光照與黑暗時(shí)間每12h交替。

1.2 藥物 戊酸雌二醇片（商品名：補(bǔ)佳樂）購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司（批號(hào)：J20130009）；益骨湯包含骨碎補(bǔ)、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、丹參、生地、山藥6味中藥，均購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，依據(jù)姚新苗等[15]研究中制備方法熬制成原生藥濃度為2g·mL-1的水提液。

1.3 儀器及試劑 DPX-L型雙能X線骨密度儀購(gòu)于美國(guó)Lunar公司；Agilent Stratagene Mx3005P定量PCR儀為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；Mini Electrophoresis system電泳系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-RAD公司；Tanon GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)購(gòu)于上海天能科技有限公司?？俁NA提取試劑盒購(gòu)于杭州寶賽生物科技有限公司（批號(hào)：RE02050）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于杭州寶賽生物科技有限公司（批號(hào)：RT02020）；DAB顯色試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司（批號(hào)：SA2023）；熒光定量試劑盒購(gòu)于杭州寶賽生物科技有限公司（批號(hào)：PM10003）；總蛋白提取試劑盒購(gòu)于南京凱基生物有限公司（批號(hào)：KGP250）；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于天根生物科技有限公司（批號(hào)：PA115-1）；抗Wnt10b抗體購(gòu)于Abcam公司（批號(hào)：ab70816）；抗β-catenin抗體購(gòu)于Proteintech公司（批號(hào)：51067-2-AP）；抗Runx2抗體購(gòu)于Abcam公司（批號(hào)：ab133261）；抗OSX抗體購(gòu)于Abcam公司（批號(hào)：ab94744）；抗Actin抗體購(gòu)于Abcam公司（批號(hào)：ab8227）；山羊抗兔抗體購(gòu)于Abcam公司（批號(hào)：ab97200）。

1.4 模型制備及分組 按數(shù)字隨機(jī)表法將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、補(bǔ)佳樂組、益骨湯組4組，每組11只。氯氨酮（5g·100g-1）腹腔注射麻醉后，模型組、補(bǔ)佳樂組、益骨湯組大鼠切除雙側(cè)卵巢，術(shù)后3d，每只去勢(shì)大鼠予青霉素4萬U/d肌肉注射，預(yù)防感染。正常組大鼠不作任何處理。建模成功率100%，各組術(shù)后均無大鼠死亡。

1.5 干預(yù)方法 術(shù)后各組大鼠以常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周，第13周開始給藥，正常組與模型組以雙蒸水10mL·kg-1灌胃；補(bǔ)佳樂組將0.36mg補(bǔ)佳樂片溶解于10mL 雙蒸水，再按 10mL·kg-1灌胃給藥[16]；益骨湯組以益骨湯水提液10mL·kg-1灌胃[17]，各組均為1次/d，共12周。

1.6 取材 12周后處死大鼠，取右側(cè)股骨，各組分別選取6只大鼠的右側(cè)股骨用于BMD測(cè)定，BMD測(cè)定完畢后迅速轉(zhuǎn)入液氮，用于Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。其余5只大鼠的右側(cè)股骨以10%甲醛固定，置于10%EDTA溶液內(nèi)脫鈣，乙醇脫水，取股骨干骺端骨組織，用于病理學(xué)觀察及免疫組化檢測(cè)。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 BMD測(cè)定 各組分別選取6只大鼠，采用雙能骨密度儀測(cè)定右股骨干骺端BMD值，單位g/cm2。

1.7.2 骨組織病理學(xué)觀察 常規(guī)石蠟包埋，5μm切片后行HE染色，光鏡下觀察。

1.7.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá) Trizol一步法提取大鼠股骨骨組織中總RNA，依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件42℃ 45min，70℃ 10min。熒光定量PCR按照試劑盒說明進(jìn)行，反應(yīng)條件為94℃ 1min，95℃ 10s，58℃10s，72℃ 10s，共40個(gè)循環(huán)。采用β-actin作為內(nèi)參，以正常組為參照組，根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算獲得各基因相對(duì)表達(dá)量。上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)的引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.7.4 免疫組化檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 每組選取5只大鼠的標(biāo)本，每只大鼠選3張石蠟切片，烘箱中65℃烤片2.5h，二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ脫蠟各15min，無水乙醇清洗二甲苯，逐級(jí)梯度乙醇浸泡5min，PBS溶液中清洗3次，每次3min，10%牛血清白蛋白室溫封閉30min，PBS清洗，一抗（1:100）4℃孵育過夜，山羊抗兔（1:400）室溫避光孵育2h，DAB顯色，晾干，封片。于200倍光鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，用Image-ProPlus 6.0分析軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)定積分光密度（integral optical density，IOD），以IOD值代表蛋白表達(dá)量。

1.7.5 Western blot檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 各組大鼠右股骨標(biāo)本超聲粉碎后加入含1%PMSF-RIPA的裂解液，冰上裂解 30min，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白100℃變性3min，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)印45min，5%脫脂奶粉封閉1h，一抗（1:500）4℃孵育過夜，二抗（1:1 000）室溫孵育1h，ECL曝光，Mini Electrophoresis system凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描測(cè)定灰度值，計(jì)算條帶的平均光密度值，以目的條帶平均光密度值與內(nèi)參條帶平均光密度值的比值代表蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多樣本均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，采用LSD-t法，方差不齊時(shí)采用Dunnettt’s T3法，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨BMD比較 與正常組比較，模型組大鼠BMD降低（P＜0.01）。與模型組比較，補(bǔ)佳樂組、益骨湯組 BMD 均升高（P＜0.05，P＜0.01），與補(bǔ)佳樂組比較，益骨湯組BMD升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明補(bǔ)佳樂、益骨湯均能改善去勢(shì)大鼠低BMD狀態(tài)，且兩者無明顯差別。見表2。

表2 各組大鼠股骨BMD比較（g/cm2，±s）Tab.2 Comparison of BMD in femur of the rats(g/cm2，±s）

表2 各組大鼠股骨BMD比較（g/cm2，±s）Tab.2 Comparison of BMD in femur of the rats(g/cm2，±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別n 股骨BMD正常組模型組補(bǔ)佳樂組益骨湯組6 6 6 6 0.247±0.049 0.169±0.031**0.218±0.015#0.236±0.320##

2.2 各組大鼠股骨骨組織病理學(xué)觀察 光鏡下可見，正常組骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列緊密、有規(guī)則，骨小梁間連接呈網(wǎng)狀，骨髓腔相對(duì)較??；模型組骨小梁結(jié)構(gòu)排列稀疏，總量明顯減少，骨小梁間連接性差，出現(xiàn)大量骨小梁盲端，骨小梁壁厚度不一致，骨髓腔增大；補(bǔ)佳樂組與益骨湯組可見骨小梁粗壯、飽滿，骨髓腔相對(duì)于模型組減小。見圖1。

圖1 各組大鼠右側(cè)股骨骨組織病理學(xué)觀察（HE染色，100×）Fig.1 Pathology observation on right femur of the rats(HE staining，100×)

2.3 各組大鼠股骨骨組織Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)比較 與模型組比較，補(bǔ)佳樂組Wnt10b、β-catenin基因表達(dá)量升高（P＜0.01，P＜0.01），益骨湯組Wnt10b、β-catenin、Runx2 基因表達(dá)量升高（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），DKK1基因表達(dá)量降低（P＜0.05）。與補(bǔ)佳樂組比較，益骨湯組Wnt10b、β-catenin、Runx2基因表達(dá)量升高（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05），表明補(bǔ)佳樂與益骨湯均能激活大鼠股骨組織中Wnt10b、β-catenin基因的表達(dá)，且益骨湯的效果優(yōu)于補(bǔ)佳樂。益骨湯還可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Runx2的表達(dá)，抑制DKK1的過表達(dá)。見表3。

表3 各組大鼠股骨骨組織 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX、DKK1 基因表達(dá)（±s）Tab.3 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2，OSX，DKK1 mRNA in femur of the rats(±s)

表3 各組大鼠股骨骨組織 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX、DKK1 基因表達(dá)（±s）Tab.3 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2，OSX，DKK1 mRNA in femur of the rats(±s)

注：與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與補(bǔ)佳樂組比較，△P＜0.05。Note:Compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01；compared with the progynova group，△P＜0.05.

組別 Wnt10b β-catenin Runx2 OSX DKK1模型組補(bǔ)佳樂組益骨湯組0.221±0.093 0.568±0.136##0.777±0.0873##△0.067±0.025 0.188±0.029##0.242±0.0483##△0.192±0.057 0.563±0.138 0.993±0.492##△0.436±0.214 0.649±0.207 1.048±0.756 2.877±1.012 2.117±0.849 1.944±1.089#

2.4 免疫組化檢測(cè)各組大鼠股骨組織Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 免疫組化檢測(cè)提示，與正常組比較，模型組 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 的 IOD 降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，補(bǔ)佳樂組 Wnt10b、β-catenin、OSX 的 IOD 升高（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），益骨湯組 Runx2、OSX 的 IOD 升高（P＜0.05，P＜0.05），Wnt10b、β-catenin 的 IOD 也有升高趨勢(shì)，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與補(bǔ)佳樂組比較，益骨湯組 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 的IOD差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明補(bǔ)佳樂能增加去勢(shì)大鼠 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 的蛋白表達(dá)，而益骨湯能增加去勢(shì)大鼠Runx2、OSX的蛋白表達(dá)，但對(duì)Wnt10b、β-catenin表達(dá)無明顯影響。見表4、圖 2-5。

表4 各組大鼠股骨骨組織中Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX蛋白表達(dá)（±s）Tab.4 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2 and OSX protein in femur of the rats(±s)

表4 各組大鼠股骨骨組織中Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX蛋白表達(dá)（±s）Tab.4 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2 and OSX protein in femur of the rats(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with the normal group，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別 n Wnt10b β-catenin Runx2 OSX正常組模型組補(bǔ)佳樂組益骨湯組5 5 5 5 15.00±5.33 9.40±1.98*17.42±2.08##15.84±4.27 38.68±3.92 17.44±7.58**30.44±11.18#27.09±7.33 21.86±11.36 1.59±0.68**11.45±3.20 16.34±4.30#17.92±4.55 10.44±1.56*20.10±3.32##18.41±3.68#

圖2 各組大鼠股骨骨組織中Wnt10b蛋白表達(dá)（200×）Fig.2 Expression of Wnt10b protein in femur of the rats(200×)

圖3 各組大鼠股骨骨組織中β-catenin蛋白表達(dá)（200×）Fig.3 Expression of β-catenin protein in femur of the rats(200×)

圖4 各組大鼠股骨骨組織中Runx2蛋白表達(dá)（200×）Fig.4 Expression of Runx2 protein in femur of the rats(200×)

圖5 各組大鼠股骨骨組織中OSX蛋白表達(dá)（200×）Fig.5 Expression of OSX protein in femur of the rats(200×)

2.5 Western blot檢測(cè)各組大鼠股骨骨組織Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) Western blot檢測(cè)提示，與正常組比較，模型組 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。與模型組比較，補(bǔ)佳樂組 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX蛋白表達(dá)量升高（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），益骨湯組 Runx2、OSX 蛋白表達(dá)量升高 （P＜0.01，P＜0.01）。與補(bǔ)佳樂組比較，益骨湯組 Wnt10b、βcatenin、Runx2、OSX蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明補(bǔ)佳樂、益骨湯均能提高去勢(shì)大鼠股骨組織中Runx2、OSX蛋白表達(dá)量，且補(bǔ)佳樂能提高去勢(shì)大鼠股骨組織中Wnt10b、β-catenin蛋白的表達(dá)量，而益骨湯對(duì)去勢(shì)大鼠股骨組織中Wnt10b、β-catenin的蛋白表達(dá)量無明顯影響。見表5、圖6。

表5 各組大鼠股骨骨組織中 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 蛋白量（±s）Tab.5 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2，OSX protein in femur of the rats(±s）

表5 各組大鼠股骨骨組織中 Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX 蛋白量（±s）Tab.5 Expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2，OSX protein in femur of the rats(±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。Note:Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，##P＜0.01.

組別 n Wnt10b β-catenin Runx2 OSX正常組模型組補(bǔ)佳樂組益骨湯組5 5 5 5 1.35±0.10 0.55±0.11**1.23±0.18##0.79±0.13 1.96±0.47 0.50±0.11**1.50±0.19##0.96±0.16 2.21±0.07 0.45±0.05**1.38±0.14##1.03±0.02##1.77±0.03 0.20±0.01**0.88±0.10##0.58±0.05##

圖6 各組大鼠股骨骨組織中Wnt10b、β-catenin、Runx2、OSX蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative expression of Wnt10b，β-catenin，Runx2，OSX protein in femur of the rats

3 討論

目前臨床上治療OP最常用的是激素替代療法，但激素替代療法副作用較多，包括睡眠障礙、情緒抑郁和頭痛，此外還可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生，乳腺癌和卵巢癌的發(fā)病率增加[18-19]。補(bǔ)佳樂作為現(xiàn)在臨床較為常用的一種外源性雌激素，主要成分為戊酸雌二醇，與人體卵巢自身分泌的雌激素類似，能夠替代內(nèi)源性雌激素的生理、生化作用，但仍然存在乳脹、情緒抑郁等副作用[20]，因而限制了其臨床應(yīng)用。

OP 屬于中醫(yī)“骨萎”“骨枯”“骨痹”的范疇，“腎主骨，生髓”，其發(fā)病機(jī)制與腎密切相關(guān)，其次與脾胃肝等相關(guān)[21]。根據(jù)中醫(yī)補(bǔ)腎活血的治療原則，筆者團(tuán)隊(duì)研發(fā)了臨床經(jīng)驗(yàn)方益骨湯（骨碎補(bǔ)、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、丹參、生地、山藥），用于OP的防治。本方以骨碎補(bǔ)、淫羊藿、補(bǔ)骨脂為君，補(bǔ)髓生精、溫陽暖腎，佐以生地、丹參、山藥活血益氣，功能為補(bǔ)腎益精、活血益氣，符合中醫(yī)藥治療OP的治則。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)、淫羊藿、補(bǔ)骨脂等補(bǔ)腎中藥中含有黃酮類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)與己烯雌酚相似，具有雌性激素樣作用[22]，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖[23-25]。筆者前期研究結(jié)果表明，益骨湯含藥血清可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化[26]，促進(jìn)骨形成，提高骨強(qiáng)度及生物力學(xué)性能[27]，改善骨質(zhì)疏松動(dòng)物血瘀的病理狀態(tài)[28]。本研究也發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)佳樂、益骨湯均能提高去勢(shì)大鼠BMD，且效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明益骨湯能較好地緩解因雌激素水平下降導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨代謝過程中具有重要意義，以Wnt/β-catenin信號(hào)通路為靶向的藥物研究，也已取得了一定進(jìn)展[29]。Stevens等[30]研究表明Wnt10b基因缺失的小鼠成骨細(xì)胞數(shù)量及活性顯著下降，導(dǎo)致OP的發(fā)生。β-catenin缺乏促使間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化[31]。筆者前期研究證實(shí)益骨湯能增高Wnt/β-catenin信號(hào)通路中βcatenin基因的表達(dá)[14]，本研究則進(jìn)一步深入研究益骨湯的作用機(jī)制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR提示益骨湯組Wnt10b、β-catenin基因的表達(dá)量高于模型組，DKK1基因表達(dá)量則低于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但Western blot和免疫組化結(jié)果均提示，益骨湯組中Wnt10b、β-catenin蛋白表達(dá)量與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。筆者推測(cè)在該通路反應(yīng)過程中，Wnt、βcatenin基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與其他物質(zhì)形成了復(fù)合物，故組織中檢測(cè)不到蛋白表達(dá)量的差異，對(duì)于其是否存在蛋白磷酸化及量效關(guān)系則需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證，這也是需要深入研究的地方。

在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，Wnt蛋白可與細(xì)胞表面特異性受體卷曲蛋白（Frizzled）受體和輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low density lipoprotein receptor associated protein antibody 5/6，LRP5/6）共受體結(jié)合，抑制糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）并促進(jìn) β-catenin 的累積，累積的β-catenin易位于細(xì)胞核中，與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）一起誘導(dǎo)Wnt信號(hào)通路靶基因的表達(dá)[32]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt發(fā)生作用需要與受體LRP5/6結(jié)合，而DKK1能與LRP5/6、跨膜受體Kremen 1/2形成三聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞，減少LRP5/6在細(xì)胞膜上的表達(dá)，以此阻斷Wnt信號(hào)向胞內(nèi)傳遞[32]。因此筆者推測(cè)在該通路反應(yīng)過程中，益骨湯可抑制DKK1基因的過表達(dá)，促使Wnt與LRP5/6形成復(fù)合物，激活Wnt信號(hào)通路，而補(bǔ)佳樂可能是直接調(diào)控該通路蛋白的表達(dá)，兩者作用機(jī)制的差異尚需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

Runx和OSX是多條信號(hào)通路的共同下游基因，其中Runx是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化、骨發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，參與成骨細(xì)胞分化過程[33]；OSX可作為 Runx2的下游基因啟動(dòng)成骨基因，發(fā)揮成骨作用[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，益骨湯能促進(jìn)Runx2、OSX蛋白的表達(dá)，表明益骨湯能通過調(diào)控Runx2、OSX蛋白表達(dá)從而調(diào)控成骨過程。但Runx2、OSX作為多條通路的共同下游位點(diǎn)，筆者推測(cè)益骨湯可能還通過其他信號(hào)通路發(fā)揮作用，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）信號(hào)通路。研究證實(shí)，Runx2也是BMP-2的靶基因，BMP-2通過轉(zhuǎn)錄因子Runx2和肌節(jié)同源盒蛋白2（muscle segment homeobox，Msx2）調(diào)節(jié) OSX 的表達(dá)[34-35]。本研究?jī)H研究了益骨湯對(duì)Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路的影響，后續(xù)研究中將對(duì)其他相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，益骨湯通過激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，從而增高BMP，這可能是益骨湯的作用機(jī)制之一。在后續(xù)研究中，將通過體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證益骨湯的作用機(jī)制，并對(duì)其他相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行探討，為益骨湯的臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

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