γ-聚谷氨酸研究進(jìn)展

陳 勉，陳 磊，孫 康，張曉元，郝榮華，劉 飛, ，朱希強(qiáng), ，凌沛學(xué),

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類(lèi)藥物工程實(shí)驗(yàn)室 多糖類(lèi)藥物發(fā)酵與精制國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)公司，山東 濟(jì)南 250101）

谷氨酸經(jīng)γ-氨基連接成線(xiàn)型聚合物γ-聚谷氨酸 （poly-gamma-glutamate, PGA）。PGA在胞內(nèi)以非核糖體依賴(lài)方式聚合，耐受蛋白酶水解，是不同于蛋白質(zhì)的多聚肽類(lèi)物質(zhì)。生物PGA有助于微生物在脅迫環(huán)境生存，又助其逃避宿主免疫監(jiān)視。PGA最早發(fā)現(xiàn)于炭疽桿菌（Bacillus anthracis）莢膜，也存在于納豆（一種傳統(tǒng)日本食物——發(fā)酵大豆）黏液，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)與葉酸共價(jià)結(jié)合的PGA。PGA單體有D-、L-和DL-混合型，常見(jiàn)DL-混合型，該差異可由產(chǎn)生菌和培養(yǎng)條件不同引起。PGA的分子量、氨基酸組成、核磁共振波譜、紅外光譜、二級(jí)結(jié)構(gòu)等特征信息已有全面解析。PGA具可生物降解、可食用、無(wú)免疫原性、安全無(wú)毒等特性，已安全應(yīng)用于食品、化妝品、藥物載體及水處理等領(lǐng)域[1-4]。

本文通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料，對(duì)PGA的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以冀為其進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 PGA在微生物、動(dòng)物及人體內(nèi)的表達(dá)

1.1 PGA在體表共生微生物中的表達(dá)

Fey等[5]的研究指出表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）是一種生活在人體皮膚表面的共生菌，含高度保守的與PGA合成相關(guān)的capBCAD操縱子，能分泌PGA，保護(hù)菌體耐受高鹽濃度，有助于菌體在人體皮膚表面存活。

Kocianova等[6]列舉了含有與合成PGA相關(guān)的capBD基因并產(chǎn)PGA的表皮葡萄球菌，如Staphylococcus capitissubsp. capitis（ATCC27840），Staphylococcus capitissubsp. ureolyticus（ATCC 49324）及Staphylococcus caprae（ATCC 51548）等，及路鄧葡萄球菌Staphylococcus lugdunensis（ATCC 43809）等。Zipperer等[7]研究了路鄧葡萄球菌，該菌為人鼻腔中的一種能生產(chǎn)天然抗生素的共生菌，該菌也含PGA合成相關(guān)的capBCA操縱子[5,8]。

1.2 動(dòng)物體內(nèi)PGA表達(dá)

Ogunleye等[1]在鼠神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)PGA與微管蛋白共價(jià)連接。Eddé等[9]的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中微管蛋白的高度異質(zhì)性主要受控于翻譯后修飾，即在谷氨酸殘基的γ-羧基上連續(xù)加入谷氨酰單元的PGA化修飾。這種修飾發(fā)生在微管蛋白與微管相關(guān)蛋白及鈣相互作用的重要區(qū)域內(nèi)，可調(diào)節(jié)微管動(dòng)力學(xué)行為。

Mcguire等[10]指出天然葉酸衍生物含2～8個(gè)谷氨酸殘基連接而成的PGA化鏈。這些PGA化葉酸的通用功能包括：作為體內(nèi)葉酸依賴(lài)性酶的輔因子；對(duì)某些不以PGA化葉酸為底物的葉酸依賴(lài)性酶具有抑制作用；對(duì)只結(jié)合了1個(gè)谷氨酸殘基就被轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)的葉酸衍生物，延長(zhǎng)其在胞內(nèi)的停留時(shí)間。不管是真核還是原核生物，以及葉酸衍生物中PGA長(zhǎng)度如何，均由同一種葉酸-聚谷氨酸合成酶完成該葉酸的PGA化修飾。

具有抗葉酸作用的甘氨酰胺核糖核苷酸（glycamide ribonucleotide，GAR）甲酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑能在體內(nèi)完成PGA化修飾。Habeck等[11]在維持標(biāo)準(zhǔn)飲食（SD）和低葉酸飲食（LFD）的荷瘤小鼠體內(nèi)，比較兩種經(jīng)放射性標(biāo)記的GAR甲酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑的分布，發(fā)現(xiàn)二者的肝臟和腎臟濃度最高。SD組小鼠肝臟中，兩種抑制劑的PGA化圖譜相似，可檢測(cè)到最長(zhǎng)聚合了6個(gè)谷氨酸殘基的PGA化形式；LFD組小鼠肝臟中，168 h后還檢測(cè)到聚合了多達(dá)7～8個(gè)谷氨酸的一種抑制劑的PGA化形式。

1.3 人體內(nèi)PGA表達(dá)

人體也有逐步聚合谷氨酸成PGA鏈的能力。季晨博等[12]指出在人體內(nèi)發(fā)揮作用的葉酸主要為PGA化葉酸。王玉等[13]指出雖然食物來(lái)源的葉酸也多以PGA化形式存在，但其在被人體吸收前預(yù)先由腸內(nèi)結(jié)合酶去除其PGA化部分。盤(pán)瑤暉等[14]指出葉酸雖廣泛分布于動(dòng)植物食品中，但在動(dòng)物和人攝入時(shí)，須被降解為游離葉酸后才能被機(jī)體吸收。人體吸收不含PGA的葉酸，而體內(nèi)發(fā)揮作用的為PGA化葉酸，由此可見(jiàn)人體具有對(duì)葉酸（無(wú)PGA）逐步添加谷氨酸的PGA化修飾能力。

彭穎等[15]研究表明PGA是在人體細(xì)胞內(nèi)合成的。研究發(fā)現(xiàn)臨床上首選治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的甲氨蝶呤（MTX）對(duì)20 %～40 %的患者無(wú)效。MTX的血漿濃度與療效不相關(guān)，需在紅細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為PGA化MTX才能發(fā)揮抗炎作用，并可通過(guò)檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)PGA化的MTX濃度來(lái)預(yù)測(cè)治效。Den等[16]持相同觀點(diǎn)，并通過(guò)進(jìn)一步的前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)影響類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者細(xì)胞內(nèi)PGA化MTX水平的更多因素。

人體內(nèi)存在合成PGA片段的酶，如葉酰多聚谷氨酸合成酶（folypolyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS），為體內(nèi)葉酸的谷氨酸末端進(jìn)一步延伸PGA鏈的合酶。Chen等[17]通過(guò)熒光原位雜交定位了FPGS基因在人類(lèi)染色體的位置，分析了其基因組成，并分別通過(guò)原核、真核系統(tǒng)表達(dá)了人FPGS酶。研究還發(fā)現(xiàn)要達(dá)到胞內(nèi)葉酸的累積，葉酸的PGA化長(zhǎng)度需達(dá)到至少3個(gè)谷氨酸以上；受試樣品中PGA化葉酸比單谷氨酸葉酸為底物時(shí)的催化效果更好。Lawrence等[18]還進(jìn)一步研究了FPGS酶的胞內(nèi)分布，發(fā)現(xiàn)人體線(xiàn)粒體內(nèi)必需自備FPGS，因?yàn)榘麧{中PGA化的葉酸無(wú)法穿過(guò)線(xiàn)粒體膜。

2 PGA降解酶

目前已發(fā)現(xiàn)多種來(lái)源的能降解PGA的酶。

2.1 噬菌體來(lái)源的酶

Kimura等[19]研究了噬菌體基因組編碼的PGA水解酶。從生產(chǎn)納豆的枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞中鑒定并純化了來(lái)自噬菌體PhiNIT1的單體PGA降解酶（PghP）。PghP酶能內(nèi)切PGA水解為寡肽，然后將其特異性轉(zhuǎn)化為含3～5個(gè)谷氨酸的PGA鹽。該酶催化機(jī)制可能與半胱氨酸殘基、金屬離子的參與有關(guān)。從噬菌體基因組中克隆并測(cè)序相應(yīng)的pghP基因。該酶蛋白序列含208個(gè)氨基酸。

2.2 細(xì)菌來(lái)源的酶

Mamberti等[20]研究了產(chǎn)PGA的枯草芽孢桿菌基因組。找出與噬菌體PghP編碼基因相似的數(shù)組基因，將其編碼產(chǎn)物與PghP相比，確定這些基因存在于枯草芽孢桿菌基因組的原噬菌體元件中，其重組產(chǎn)物顯示PGA降解活性。

Tian等[21]研究增強(qiáng)地衣芽孢桿菌WX-02中PGA降解酶的pgdS基因表達(dá)的作用。將該基因在大腸桿菌中異源表達(dá)PGA降解酶PgdS，該酶最適pH 5.5～6.5，最適溫度37～45 ℃，Zn2+，Mn2+，Ca2+和SDS均能提高酶活，而Hg2+或Cu2+則抑制酶活性。γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶（GGT）[1,22-23]、γ-谷氨?；饷福≒gsS）[1]、CapDPGA解聚酶等也具有降解PGA的活性[1]。

2.3 動(dòng)植物組織內(nèi)的酶

吳靜等[24]研究了動(dòng)、植物組織器官中廣泛存在的胞外羧肽酶，一類(lèi)專(zhuān)一性地從肽鏈的C末端逐個(gè)降解、釋放游離氨基酸的肽鏈外切酶。其中羧肽酶G，又名谷氨酸羧肽酶（EC 3.4.17.11），作用于含有N-?；孜顲-末端，如PGA，釋放谷氨酸，用于MTX的解毒及抗體導(dǎo)向酶-前藥療法。

3 血清PGA檢測(cè)

Gates-Hollingsworth等[25]建立了兔血清中D-PGA的側(cè)流免疫分析（lateral flow immunoassay，LFA）快速檢測(cè)方法，檢測(cè)限可低至1 ng/ml，平均檢測(cè)時(shí)間為22±4.2 h。該方法中PGA的關(guān)鍵單克隆抗體8B10，是通過(guò)將合成的D-PGA寡聚體與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）偶聯(lián)，與適當(dāng)佐劑一并皮下免疫CD1小鼠，再通過(guò)雜交瘤技術(shù)制得。

4 PGA免疫原性研究

Schneerson等[26]將天然及合成的D-PGA、牛血清白蛋白（BSA）及重組炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原（protective antigen，PA）或重組銅綠假單胞菌外毒素A（rEPA）結(jié)合構(gòu)建免疫原。對(duì)5～6周齡小鼠進(jìn)行3次免疫注射，考察其免疫原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)接合了D-PGA的D-PGA/BSA、D-PGA/rPA、D-PGA/rEPA免疫原大都在第2次免疫后產(chǎn)生數(shù)百EU的抗D-PGA抗體，第3次免疫后抗體數(shù)量再次劇增達(dá)數(shù)千EU；而天然D-PGA只顯示痕量抗體水平，第3次免疫后可測(cè)抗體水平也僅低至4.4 EU。

Wyeth等[27]指出DL-PGA與載體蛋白偶聯(lián)后能產(chǎn)生抗體反應(yīng)，而單獨(dú)PGA免疫原性微弱。Gon?alves等[3,28]推測(cè)之所以尚未發(fā)現(xiàn)PGA免疫原性，可能與其在體內(nèi)可被降解為谷氨酸有關(guān)。

Ma等[29]研制了基于PGA/透明質(zhì)酸的可注射水凝膠，用于控制蛋白質(zhì)遞送，顯示良好生物相容性。Renò等[30]研制了含PGA的水凝膠復(fù)合材料，可增加人血漿蛋白和人角質(zhì)細(xì)胞黏附量，具有良好的生物相容性和力學(xué)特征，有望用于軟組織工程。

5 PGA在藥品、化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用

5.1 對(duì)抗腫瘤藥物的修飾

周紅艷等[31]研究指出MTX在體內(nèi)FPGS的作用下可連接聚合度為2～6的谷氨酸鏈，形成PGA化MTX，再與葉酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合二氫葉酸還原酶（DHFR），從而減少用于核酸和蛋白質(zhì)合成的四氫葉酸生成而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。在含有1～7個(gè)谷氨酸的PGA化MTX中，含4～6個(gè)谷氨酸的PGA化MTX對(duì)其抗腫瘤效應(yīng)起主要作用。Allegra等[32]研究了單谷氨酸化MTX、PGA化MTX（含2～5個(gè)谷氨酸）對(duì)人MCF-7乳腺癌細(xì)胞胸苷酸合酶的抑制作用，PGA化MTX比單谷氨酸化MTX作用高75～300倍，對(duì)5-氟-2’-脫氧尿苷-5’-單磷酸、葉酸輔因子和胸苷酸合酶的三元復(fù)合物形成的干擾程度則取決于葉酸的PGA化狀態(tài)。

Bo等[33]將pH敏感PGA/殼聚糖水凝膠開(kāi)發(fā)為靶向結(jié)腸的口服給藥系統(tǒng)，觀察到該水凝膠的細(xì)胞相容性處于可接受范圍。Frank等[34]研究了負(fù)載有抗癌藥物多柔比星（DOX）的PGA/殼聚糖納米顆粒，體外研究證明該納米顆粒對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系（HN-5a）顯示出細(xì)胞毒性。

5.2 對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用

Antunes等[35]研究發(fā)現(xiàn)PGA促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）生成，因此添加PGA對(duì)未來(lái)軟骨再生具有益影響。PGA對(duì)MSC、鼻軟骨細(xì)胞（NC）細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。Schlegel等[36]的研究發(fā)現(xiàn)添加PGA能減少用于沉默體內(nèi)基因的siRNA陽(yáng)離子脂質(zhì)體（siRNA-lipoplex）的體外及體內(nèi)毒性。Gon?alves等[28]以PGA/殼聚糖聚電解質(zhì)復(fù)合物作為趨化因子基質(zhì)衍生因子-1（SDF-1）載體，可實(shí)現(xiàn)SDF-1在120 h內(nèi)的連續(xù)釋放，使人類(lèi)MSC遷移增加6倍，達(dá)16.2±4.9個(gè)細(xì)胞/mm2，促進(jìn)損傷組織修復(fù)。

5.3 臨床研究

Park等[37]研究高分子量PGA對(duì)飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠的肥胖癥和脂質(zhì)代謝的影響。經(jīng)8周雙盲安慰劑對(duì)照的臨床研究，發(fā)現(xiàn)20名補(bǔ)充高分子量PGA（150 mg/d）的女性受試者總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇濃度有降低傾向，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

Kim等[38]對(duì)99名健康志愿者進(jìn)行隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照臨床研究，結(jié)果表明口服PGA可增加人自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）活性，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。Sung等[39]發(fā)現(xiàn)口服PGA能促進(jìn)Th1/Th17細(xì)胞分化，可在早期應(yīng)用PGA防止Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎發(fā)展。

Koo等[40]回顧性觀察研究發(fā)現(xiàn)口服PGA可有助于高危HPV陽(yáng)性陰道上皮內(nèi)瘤變（VAIN）患者的細(xì)胞學(xué)變化消退和病毒載量降低，表明PGA有希望用于初級(jí)或持續(xù)性VAIN的治療。

5.4 在化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用

作為化妝品原料，PGA已被收錄于《已使用化妝品原料名稱(chēng)目錄》（2014年版）和《國(guó)際化妝品原料標(biāo)準(zhǔn)中文名稱(chēng)目錄》（2010年版），廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域，用作皮膚調(diào)理劑、保濕劑及頭發(fā)調(diào)理劑等。

Isago 等[41]研制了由PGA和透明質(zhì)酸經(jīng)冷凍干燥制得的護(hù)膚品，用于化學(xué)去皮后護(hù)理。Bioleaders Corporation公司[42]研制了以PGA為活性成分的透明質(zhì)酸酶抑制劑，能有效抑制降解皮膚真皮透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸酶，具有維持皮膚彈性、抑制炎性細(xì)胞滲透而緩解過(guò)敏的作用。

6 結(jié)論

已有研究表明PGA是生物體內(nèi)固有成分，可被機(jī)體自行合成和降解。外源PGA未見(jiàn)明顯免疫原性，血清中PGA已可被定量檢測(cè)。研究還發(fā)現(xiàn)存在天然的PGA降解酶，可用于迅速清除PGA。PGA已在藥品和化妝品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。上述研究報(bào)道將為PGA的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。