香酥兔肉加工過程中揮發(fā)性成分的研究

宋麗坤， 張 帆， 李 誠， 馮朝輝， 劉愛平， 楊 勇， 劉韞韜

（四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安 625014）

我國是兔肉生產(chǎn)大國，兔肉制品種類繁多，市場上已有兔肉干、兔肉松、香酥兔肉等產(chǎn)品[1]。為了滿足消費者需求，有關人員進行了大量研究。崔震昆等[2]研究了麻辣風味兔肉的加工工藝，分析了腌漬、預煮、鹵制等工序?qū)Ξa(chǎn)品口感的影響。孫逸等[3]優(yōu)化了泡椒兔肉加工工藝，并對加工過程中理化性質(zhì)的變化做了分析。為了全面系統(tǒng)地了解經(jīng)復合酶和改良劑處理的香酥兔肉加工過程中揮發(fā)性成分的組成及變化，作者采用頂空固相微萃取裝置收集香酥兔肉加工階段的主要揮發(fā)性物質(zhì)，并使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對揮發(fā)性成分進行分析鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兔肉：市售；木瓜蛋白酶（10萬U/g）、胰蛋白酶（3 500 U/g）：諾奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

SPME手動進樣手柄、75μmCAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司產(chǎn)品；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程 兔肉→酶處理→改良劑處理→預煮→冷卻→成型切丁→油炸→包裝→殺菌→品質(zhì)評定。

1.3.2 原料兔肉預處理操作要點 選擇健康無病的肉兔，按常規(guī)方法宰殺、修整，清洗去血污、剔骨頭、修整等。將整理好的兔肉浸泡100 mL酶解液中，酶解溫度：45℃；酶解時間：60 min，木瓜蛋白酶用量：300 U/g兔肉；胰蛋白酶用量：150 U/g兔肉。加入質(zhì)量分數(shù)1%食鹽與兔肉全部混合均勻后，再加入質(zhì)量分數(shù)0.6%小蘇打、10%變性淀粉、4%大豆蛋白作為品質(zhì)改良劑，進行腌制。將腌制好的兔肉預煮，切成小塊后，在90℃的溫度下對處理好的兔肉進行真空油炸，油炸時間10 min。炸完后撈出，充分瀝油。

1.3.3 揮發(fā)性成分的檢測

1）HS-SPME萃取條件 將樣品絞碎稱取3 g于15 mL樣品瓶中，置于水浴鍋中平衡10 min，然后將萃取纖維頭暴露在樣品上方，在一定的吸附溫度下吸附一定的時間后[4]，縮回纖維頭，抽出針頭，GC進樣，250℃解析5 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。以總峰面積為檢測指標優(yōu)化萃取條件。重復3次取平均值。

2）GC-MS檢測條件 色譜條件：HP-5MS石英彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250℃，接口溫度280℃；升溫程序參考文獻[5]的方法并作優(yōu)化：初始溫度35℃，保持3 min，以4℃/min升溫至75℃，保留 1 min；第二階段以5℃/min升溫至120℃，保留1 min；第三階段以8℃/min升溫至 230℃，保留 3 min；載氣（He）流量1.0 mL/min，進樣量 1.2 μL；不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV，離子源溫度200℃，燈絲電流 150 μA；質(zhì)量掃描范圍：10～450。

3）定性定量分析 定性：利用質(zhì)譜結果和保留指數(shù)定性，通過計算機檢索與 NIST.11提供的標準質(zhì)譜對照，根據(jù)匹配度，并結合已有的文獻進行定性分析。保留指數(shù)是利用分析樣品的GC-MS的條件對 C7～C30的正構烷烴混合標準品進行檢測，根據(jù)以下公式計算

式中：n和n＋i分別為未知物流出前后正構烷烴的碳原子數(shù)；t′（n）和 t′（n＋i）為相應的正構烷烴的調(diào)整保留時間；t′（i）為待測組分的調(diào)整保留時間（t′（n）＜t′（i）＜t′（n＋i））。

定量：每個樣品采用相同的HS-SPME-GC-MS條件，重復3次試驗；某一組分峰面積為3次試驗的峰面積平均值；采用峰面積歸一法，利用峰面積及峰面積占總面積的百分比進行定量分析。

4）方法學考察 取同一批樣品，按HS-SPME萃取條件的方法萃取揮發(fā)性物質(zhì)，并按GC-MS檢測條件連續(xù)進樣5次，分別對共有峰的相對峰面積進行統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME萃取條件的確定

2.1.1 萃取頭的選擇 根據(jù)王珺等[6]的研究，用75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）涂層萃取頭可有效萃取兔肉中的揮發(fā)性風味成分。

2.1.2 萃取溫度的選擇 頂空固相微萃取處理中，萃取溫度對香酥兔肉揮發(fā)性成分色譜總峰面積的影響如圖1所示，隨著萃取溫度的增加，色譜總峰面積呈現(xiàn)出先增大后緩慢減小的趨勢。溫度較低時，萃取頭未達到其最大萃取效率，總峰面積為最低值，隨著溫度的升高，萃取效率有所增加，80℃時總峰面積達到最大值，之后再隨著溫度的升高，色譜總峰面積緩慢下降。這是因為萃取溫度對SPME法的影響具有兩重性：溫度升高可以加強樣品中分子的熱運動，有利于分析物在頂空基質(zhì)中的分配，加快分析速度[7]；但同時溫度的增加會增加萃取頭固有組分的解吸[8-9]，從而使分析物在萃取涂層上的吸附量減少，影響萃取頭的萃取效率。由方差分析結果表明，4個不同萃取溫度之間存在顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。Q檢驗發(fā)現(xiàn)，80℃與60、70、90℃總峰面積間P值均小于0.01，差異極顯著，作者選擇80℃為頂空固相微萃取的最宜萃取溫度。

圖1 萃取溫度對總峰面積的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on total peak area

表1 方差分析結果Table 1 Analysis of variance

2.1.3 萃取時間的選擇 由圖2可知，隨著萃取溫度的延長，揮發(fā)性成分色譜總峰面積在初始階段呈上升趨勢，在45 min時色譜總峰面積達到最大值，之后變化緩慢。固相微萃取是一個吸附平衡過程，吸附時間依賴于分析物的分配系數(shù)及對樣品的攪拌程度[10]，萃取時間過久，易揮發(fā)性物質(zhì)會從纖維頭上脫附，而萃取時間過短，部分物質(zhì)尤其是高沸點、難揮發(fā)的分析物不能及時被纖維頭吸附[11]。由方差分析結果表明，4個不同萃取時間之間存在顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。故綜上所述，萃取時間選擇為45 min最宜。

圖2 萃取時間對總峰面積的影響Fig.2 Effect of extraction time on total peak area

表2 方差分析結果Table 2 Analysis of variance

通過對頂空固相微萃取萃取條件的分析，基本確定樣品萃取溫度為80℃，萃取時間為45 min，萃取頭為 75 μm CAR/PDMS。

2.1.4 方法的重復性 采用峰面積和保留時間作為重復性的評價指標，一般保留時間的變異系數(shù)不大于1%，峰面積的變異系數(shù)不大于5%時說明數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好[12]。

油炸兔肉檢測出的31種化合物中，有27種成分的保留時間變異系數(shù)均小于1%，24種成分的相對峰面積變異系數(shù)均小于5%，說明對于油炸兔肉揮發(fā)性成分的分析重復性較好。

2.2 加工過程中揮發(fā)性成分檢測結果

除去少量分析時萃取頭帶來的硅氧烷類雜質(zhì)峰及增塑劑污染雜質(zhì)峰[13]，在香酥兔肉4個加工階段（鮮肉、嫩化、腌制、油炸）樣品中共檢測出60種揮發(fā)性風味物質(zhì)，主要為烴類、醛類、酯類、醇類、酮類、胺類、酚類、酸類和雜環(huán)類化合物，其中烴類24種、醛類14種、酯類3種、酮類3種、酚類2種、酸類2種、醇類2種、醚類1種、雜環(huán)類化合物7種，烴類、醛類及雜環(huán)類化合物的相對含量較多。在油炸兔肉加工過程中不同階段檢測出7種共有化合物，分別是己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、苯乙烯、反-2-辛烯醛、2-正戊基呋喃，這與李莉[14]在陳皮兔加工工藝優(yōu)化及揮發(fā)性風味物質(zhì)研究中的實驗結果基本一致。另外，在加工過程中原料肉中檢測出揮發(fā)性成分18種，嫩化肉19種，腌制肉27種，油炸肉31種。4個階段檢測出的揮發(fā)性成分中相對質(zhì)量分數(shù)最高的物質(zhì)均為己醛，這與陳紅霞[4]研究結果一致；己醛是肉類食品在烹制過程中由于油脂初級氧化和后續(xù)深度氧化而產(chǎn)生的；可以由油酸、亞油酸和花生四烯酸氧化而產(chǎn)生，也可以由其他的不飽和醛降解得到；對烹制肉類食品特殊的香味起到積極的貢獻作用。

肉類制品在加工過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物主要來源于美拉德反應、脂肪氧化、氨基酸及硫胺素的降解等過程[15]，目前已鑒定出的化合物主要包括醛類、烴類、酮類、酯類、醇類、酚類、呋喃、吡嗪等[16]。作者鑒定出的香酥兔肉加工過程中各階段樣品揮發(fā)性物質(zhì)種類和相對含量較為復雜，結果由圖3、表5可知。原料肉中檢測出烴類6種（15.05%）、醛類7種 （23.93%）、酯類2種 （0.93%）、 醚類1種（5.72%）等；嫩化肉中檢測出烴類11種（31.12%）、醛類7種（27.25%）、雜環(huán)類1種（2.81%）；腌制肉中檢測出醛類 12種（41.97%）、酮類 3種（6.55%）、烴類 5種（3.48%）、雜環(huán)類 3種（7.09%）等；油炸肉中檢測出烴類 11種（22.88%）、醛類 7種（25.81%）、醚類1種（3.21%）、雜環(huán)類7種（29.69%）等。 其中，油炸肉中檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)種類最多，主要為醛類、烴類和雜環(huán)類化合物。馬相杰等[17]在研究美拉德反應與肉味變化中發(fā)現(xiàn)熟肉制品中呋喃、酮類、含硫化合物、吡咯和吡嗪等揮發(fā)性物質(zhì)主要是由美拉德反應產(chǎn)生的；Ouweland[18]發(fā)現(xiàn)吡嗪是美拉德反應產(chǎn)生的一組主要的揮發(fā)性物質(zhì)。Reinccius等[19]發(fā)現(xiàn)肉香味中呋喃、噻吩等化合物也與美拉德反應有關，而本研究中兔肉在油炸階段檢測出的2，3，5-三甲基吡嗪占總組分的比例高達17.99%，呋喃、吡啶和噻吩等雜環(huán)類物質(zhì)也都有出現(xiàn)，所以，兔肉在油炸階段檢測出的雜環(huán)類物質(zhì)可能是由于肉品中氨基類化合物與羰基類化合物之間相互作用發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生的。本實驗各加工階段樣品中均檢測出大量的烴類、醛類化合物，這些物質(zhì)可以與氨基化合物進一步發(fā)生美拉德反應、Strecker降解反應、硫胺素熱解等復雜反應，形成呋喃衍生物、酯類、醛類、酮類等多種風味物質(zhì)，所以，在兔肉加工過程中脂肪氧化對風味的形成也有重要作用。

2.3 加工過程中主要特征揮發(fā)性物質(zhì)

烴類物質(zhì)香味閾值較高，一般對肉品風味的直接貢獻不大，但在各加工階段被檢測出的烴類物質(zhì)種類繁多，相對含量較高，所以有助于提高兔肉的整體風味。

醛類主要來自脂肪的氧化，感覺閾值較低，且其檢測出的種類和相對含量均比較高，所以對肉品風味貢獻較大。本實驗鑒定出的醛類物質(zhì)主要是飽和醛及不飽和醛，飽和直鏈醛含量較高，主要有己醛、辛醛、壬醛和庚醛等，不飽和醛主要有反式-2-庚烯醛、反式-2-辛烯醛、反式-2，4-癸二烯醛、反，反-2，4-任二烯醛和反式-2-壬烯醛等，它們大部分由亞油酸和油酸氧化生成，其中主要貢獻物質(zhì)以己醛、苯甲醛、辛醛、壬醛、庚醛、反式-2-庚烯醛和反式-2-辛烯醛為主。醛類相對分子質(zhì)量較低（C3～C4）的醛有強烈刺激性的氣味，中等相對分子質(zhì)量（C5～C9）的醛具有清香、酯香和油香的風味，而相對分子質(zhì)量較高的醛具有柑橘或橘子皮的風味。樣品中檢測出的醛類大多都介于C5與C9之間，屬于中等相對分子質(zhì)量的醛，能形成肉品清香、酯香等風味，且相對含量較高，所以醛類物質(zhì)在油炸兔肉加工過程中的貢獻較大。

雜環(huán)化合物如吡嗪、吡啶、呋喃類化合物在加工過程中出現(xiàn)的比較多，其閾值較低，是肉品中最重要的風味呈味物質(zhì)。雜環(huán)類化合物主要來源于氨基酸和還原糖之間的美拉德反應，氨基酸的熱降解和硫胺素的熱解，本實驗中油炸階段產(chǎn)生較多。油炸階段檢測出的吡嗪類化合物是美拉德反應的中間產(chǎn)物，具有強烈的烤香和堅果味香氣；吡啶類化合物如吡啶、3-氨基吡啶、2-丙基吡啶具有青香和堅果香味；呋喃類化合物具有果香味、咖啡味和焦香味，其形成途徑主要為碳水化合物降解反應和多不飽和脂肪酸熱氧化反應，通常與熱處理相關聯(lián)，也是美拉德反應的產(chǎn)物。雜環(huán)類化合物在四個加工工序中油炸階段檢測出最多，所以雜環(huán)類化合物在油炸階段是主要貢獻物質(zhì)。此外，2-戊基呋喃具有青豆味、甜香味，是亞油酸的自動氧化產(chǎn)物，被認為是大豆油回味的一種化合物，在4個加工階段均有檢出，在對肉品加工過程中良好風味的產(chǎn)生也有積極的貢獻作用。

酯類、酚類、醚類、醇類、酮類物質(zhì)，大部分能產(chǎn)生令人愉快的香味，其中乙酸香葉酯呈花香、柑香、漿果香；棕櫚酸甲酯呈脂肪香、乳酪香、油脂香；百里香酚呈辛香、藥香、酚香、木香；茴香腦呈茴香、辛香料、甘草香。對油炸兔肉在加工過程中產(chǎn)生良好的風味具有一定的貢獻作用。

3 結語

作者采用HS-SPME法從香酥兔肉4個加工階段（鮮肉、嫩化、腌制、油炸）中萃取揮發(fā)性成分，并采用GC-MS進行分析。實驗結果表明：頂空固相微萃取最宜萃取溫度為80℃，萃取時間為45 min。在GC-MS分析中共鑒定出了60種揮發(fā)性物質(zhì)，主要揮發(fā)性化合物包括：醛類、烴類、酚類、醚類、酸類、酮類和雜環(huán)類化合物等，其中，烴類、醛類和雜環(huán)類的相對含量較多。在4個加工階段中檢出7種共有化合物，分別是己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、苯乙烯、反-2-辛烯醛、2-正戊基呋喃。在加工過程中，貢獻最大的為醛類物質(zhì)，以己醛、苯甲醛、辛醛、壬醛、庚醛、反式-2-庚烯醛和反式-2-辛烯醛為主；此外，油炸階段伴隨著美拉德反應、脂肪氧化等反應的發(fā)生，揮發(fā)性成分中檢測出的大量雜環(huán)類化合物如吡嗪、吡啶、呋喃等為良好風味的產(chǎn)生也作出較大貢獻。

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