HPLC-ELSD測(cè)定靈芝及其孢子粉中膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)

王亞濤 ， 劉艷芳 ， 張芝華 ，3， 張 忠 ，張勁松， 王晨光， 周 帥， 唐慶九*

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海201306；2.國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403；3.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海201418；4.上海百信生物科技有限公司，上海 201403）

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種名貴中藥材，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、降血糖和保肝等多種藥理作用[1-5]。靈芝孢子粉是在靈芝生長(zhǎng)成熟期從靈芝菌褶中彈射出來(lái)的極其微小的卵形生殖細(xì)胞，文獻(xiàn)報(bào)道與子實(shí)體有類似的功效[6]，目前被廣泛用于保健食品中。靈芝及其孢子粉中含有多種化學(xué)成分如多糖、三萜和核苷等[6-7]。1998年侯翠英等[8]還從靈芝中分離純化出兩種生物堿，即膽堿和甜菜堿。膽堿具有促進(jìn)腦發(fā)育、提高記憶能力、調(diào)控信息傳遞、促進(jìn)脂肪代謝和降低血清膽固醇等生理功能[9-13]。

目前膽堿的檢測(cè)方法有雷氏鹽比色法[14]、雷氏鹽重量法[15]以及酶比色法[16]等，由于這些方法操作繁瑣，干擾因素多，選擇性差等不足之處，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的高效液相色譜法[17-19]和離子色譜法可以準(zhǔn)確地測(cè)定膽堿的含量。目前靈芝及其孢子粉中膽堿的含量測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道，因此作者建立一種高效液相色譜快速高效檢測(cè)靈芝中膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，為靈芝及其孢子粉中質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝及其孢子粉 （泰山）：山東泰安農(nóng)科院提供；靈芝及其孢子粉（浙江）：浙江龍泉靈芝基地提供。

膽堿：購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；乙腈（色譜純）：購(gòu)自美國(guó)Dikma公司。

1.2 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Waters 2424型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；KQ-600B型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫混勻儀：杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；5415D微型離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX 300-SCX陽(yáng)離子交換色譜柱（4.6mm×250mm ，5μm），柱溫 30 ℃；流動(dòng)相：乙腈（A）-質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.3%乙酸銨（B），V（A）∶V（B）=60∶40，等度洗脫；流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；運(yùn)行時(shí)間：25 min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，漂移管溫度：60℃；噴霧器：模式為加熱；霧化氣：凈化空氣，壓力為172.4 kPa。

1.3.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取膽堿111.1 mg，用超純水稀釋，然后用1 mol/L的醋酸調(diào)節(jié)pH至中性，再轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，得1 mg/mL膽堿標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

1.3.3 提取方法的比較 加熱提?。壕_稱取靈芝孢子粉0.5 g于離心管中，加入蒸餾水10 mL，密封，置恒溫混勻儀中提取，設(shè)定溫度60℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，時(shí)間 60 min；待提取結(jié)束后，冷卻至室溫，離心，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)高效液相系統(tǒng)分析測(cè)定。用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇代替蒸餾水進(jìn)行以上操作，每組處理做3組平行。

超聲提取：精確稱取靈芝孢子粉0.5 g于離心管中，加入所選提取溶劑10 mL，密封，置超聲波清洗儀中，室溫超聲提取60 min，后續(xù)操作同上。將超聲波清洗儀溫度設(shè)為60℃，超聲提取30 min和60 min兩組樣品，其他操作同上。

1.3.4 提取條件的優(yōu)化 按照1.3.3實(shí)驗(yàn)確定的提取方法，設(shè)定提取時(shí)間分別為 30、60、120、180 min，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定提取時(shí)間；設(shè)定提取溫度分別為40、60、80、100 ℃， 比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定提取溫度；設(shè)定料液質(zhì)量體積比為 1 g∶10 mL～1 g∶60 mL，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定料液質(zhì)量體積比。

1.3.5 樣品中膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 按照1.3.3和1.3.4確定的樣品前處理方法和1.3.1的色譜條件測(cè)定樣品中膽堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件確定

2.1.1 流動(dòng)相優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)中用醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，結(jié)果表明，乙酸銨的pH值越小，檢測(cè)器的基線噪音越小，峰型也變好，考慮色譜柱的pH值使用范圍，最終將乙酸銨pH調(diào)節(jié)為3.28，此時(shí)，峰型和基線良好，靈敏度較高。調(diào)節(jié)流動(dòng)相A和B的比例。結(jié)果表明，乙腈比例越高，樣品色譜峰的保留時(shí)間越長(zhǎng)，這應(yīng)該是流動(dòng)相的極性減弱導(dǎo)致的；另外，考慮到樣品峰面積在 V（A）∶V（B）=60∶40 時(shí)最大，故確定流動(dòng)相 V（A）和 V（B）的比例為 60∶40。

2.1.2 檢測(cè)器條件優(yōu)化 漂移管溫度由60℃變?yōu)?0℃，基線噪音減小，但同時(shí)樣品峰信號(hào)也變小，其他無(wú)明顯變化，故漂移管溫度確定為60℃。

膽堿標(biāo)準(zhǔn)品和靈芝孢子粉樣品的高效液相圖譜如圖1所示，可以看到膽堿的出峰時(shí)間在18 min，靈芝孢子粉樣品中膽堿和其他成分可有效分離。

圖1 膽堿標(biāo)準(zhǔn)品（a）和樣品（b）的高效液相圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of choline standard（a） and test sample（b）

2.2 樣品提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑和提取方法的比較 分別用蒸餾水和95%乙醇作為溶劑，對(duì)靈芝孢子粉中膽堿提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明：水作為提取溶劑所得膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.611 mg/g，顯著（P≤0.05）高于體積分?jǐn)?shù)95%乙醇作為提取溶劑，故選擇蒸餾水作為提取溶劑。對(duì)超聲提取和加熱提取兩種方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：超聲時(shí)間在30～60 min，超聲溫度在25～60℃范圍內(nèi)，膽堿提取量無(wú)顯著性差異 （P＞0.05），說(shuō)明超聲時(shí)間大于30 min后，時(shí)間和溫度對(duì)超聲提取結(jié)果基本無(wú)影響。超聲提取的膽堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.579 mg/g，低于加熱提取膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)，故選擇加熱提取。

2.2.2 提取條件比較 當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，可以達(dá)到較好的提取效果，且顯著性分析表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，膽堿提取量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），故確定提取時(shí)間為60 min。當(dāng)提取溫度大于60℃，可以達(dá)到較好的提取效果，且在60～100℃范圍內(nèi)膽堿提取量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），故提取溫度確定為中間值80℃。料液質(zhì)量體積比在1 g∶10 mL～1 g∶40 mL范圍內(nèi)，膽堿提取量隨著提取溶劑的增加而增加；料液質(zhì)量體積比大于1 g∶40 mL時(shí)，膽堿提取量略有減少，故確定料液質(zhì)量體積比為1 g∶30 mL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用超純水逐級(jí)稀釋為不同濃度，測(cè)定相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下對(duì)照品的峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的對(duì)數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，以峰面積的對(duì)數(shù)（lgA）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y=1.540 9X+2.500 3，R2=0.999 8，表明膽堿在 6.25～200 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 檢測(cè)限和定量限 計(jì)算2.3.1中不同濃度對(duì)照品溶液的信噪比（S/N），以S/N大于等于3確定檢測(cè)限為6 μg/mL，S/N大于等于10確定定量限為12 μg/mL。按照1.3.1的色譜條件，分別對(duì)檢測(cè)限和定量限的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算信噪比。結(jié)果表明：檢測(cè)限的平均信噪比為 3.12，RSD為2.24%；定量限的平均信噪比為 10.05，RSD為1.28%。

表1 提取溶劑和提取方法的比較結(jié)果Table 1 Results of different extraction solvents and extraction methods

2.3.3 精密度 按照1.3.1的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次50 μg/mL的對(duì)照品溶液，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明：對(duì)照品峰面積的RSD為0.84%，表明儀器的精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性 精密稱取同一批次樣品6份，按照1.3.3和1.3.4確定的樣品前處理方法制備供試液，按照1.3.1的色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明：樣品中膽堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.654 mg/g，RSD為0.67%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性 按照1.3.3和1.3.4確定的樣品前處理方法制備供試液，分別在 0、2、4、6、12、24 h 按1.3.1的色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明：供試液中膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.91%，表明供試液在24 h內(nèi)膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率 按照2.3.4測(cè)出樣品中的膽堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，添加等量的膽堿標(biāo)準(zhǔn)品于樣品中，按照1.3.3和1.3.4確定的樣品前處理方法制備供試液，按1.3.1的色譜條件測(cè)定，做6組平行。加樣回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明：該方法的加樣回收率在96.54%～102.85%范圍內(nèi)，平均回收率為100.37%，RSD為2.86%，表明該方法回收率良好。

2.4 樣品中膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表3可知，不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉和子實(shí)體膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)都不同，并且同一產(chǎn)地的靈芝孢子粉膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著（P≤0.05）高于靈芝子實(shí)體。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery experiments

表3 樣品測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of sample determination

3 討 論

示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器都是通用型檢測(cè)器，但是示差折光檢測(cè)器對(duì)壓力和溫度等變化敏感，靈敏度較低，且不能用于梯度洗脫，而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器要求樣品組分不易揮發(fā)，流動(dòng)相為易揮發(fā)溶劑，且是一種破壞性檢測(cè)器。作者首先選擇了示差折光檢測(cè)器，但是發(fā)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)基線噪音大，考慮到可能是由于泵將流動(dòng)相A和B混合時(shí)，引起流量不穩(wěn)所致，故將流動(dòng)相A和B提前混合后使用，結(jié)果基線噪音有所改善，但依然較大，并且色譜峰存在嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象；改用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器后，檢測(cè)信號(hào)的基線噪音小，且不受流動(dòng)相A和B的混合方式影響，色譜峰也不存在拖尾現(xiàn)象，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

膽堿是一種離子化合物，堿性較強(qiáng)，作者選用陽(yáng)離子交換色譜柱[19]，為了使膽堿溶液的pH在色譜柱的要求范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)前用醋酸將膽堿溶液調(diào)節(jié)為中性。樣品水提物中膽堿的保留時(shí)間為18 min，峰較小，但峰型良好，并能和其它物質(zhì)峰有效分離，這表明該色譜柱在本實(shí)驗(yàn)條件下適合靈芝孢子粉中膽堿的分離檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間為14 min處，有一較大的單一色譜峰，該物質(zhì)目前尚不明確，需另做深入研究。

作者建立了運(yùn)用HPLC_ELSD測(cè)定靈芝及其孢子粉中膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，該方法簡(jiǎn)便快速，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率均良好，可以用來(lái)進(jìn)行靈芝及其孢子粉中膽堿的定性分析。目前靈芝類產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)主要是多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)，膽堿是靈芝中的一種重要組成成分，具有多種生理功能，將來(lái)可以考慮把膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)靈芝類產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。

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