斑馬魚毒性測定在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

吳李娜 郭春麗 孫薇薇 李曉玲 龍騰騰 岳 旺 張繼國

(1.青島黃海學(xué)院，山東 青島 266427； 2.青島市立醫(yī)院，山東 青島 266001； 3.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)教學(xué)多用哺乳動(dòng)物小鼠測定毒性，存在成本高、飼養(yǎng)困難、易被咬傷和倫理等問題。斑馬魚(Zebrafish)可用于急性毒性測定研究，是一種可替代小鼠有前途的新型脊椎動(dòng)物模型，國內(nèi)外已有報(bào)道[1-2]斑馬魚也可用作神經(jīng)病學(xué)抗癲癇動(dòng)物模型[3]。本研究用斑馬魚及小鼠進(jìn)行煙霧水溶液急性毒性測定，觀察煙霧水溶液對斑馬魚和小鼠行為及死亡率的影響，探討斑馬魚作為毒性監(jiān)測和教學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料與動(dòng)物

成年斑馬魚15條，雌雄兼用，購自青島觀賞魚市場，體長(31±4)mm，體質(zhì)量(240±20 mg)，水族箱中馴養(yǎng)3 d以上，正常喂食，每天2次，正式實(shí)驗(yàn)前24 h禁食。室溫與水溫控制在(24±2)℃，晝夜自然照明，均于上午9:00開始。

成年昆明種小鼠9只，雌雄兼用，由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量(24±2)g。正常飲食，室溫(24±2)℃，正式實(shí)驗(yàn)前禁食24 h。晝夜自然照明，均于上午9:00開始。

實(shí)驗(yàn)用圓柱形水族箱，直徑20 cm，高15 cm，市場購得；便攜式玻璃水煙壺，8 cm×6 cm×10 cm，購自溫州亨達(dá)煙具廠；實(shí)驗(yàn)用水為市售礦泉水；香煙為泰山牌過濾嘴香煙，市場購得，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量13 mg。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1煙霧水溶物對斑馬魚急性毒性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分3組：空白對照組、煙霧水溶液高劑量組、煙霧水溶液低劑量組。實(shí)驗(yàn)用水煙壺實(shí)驗(yàn)前均依次用等量洗滌劑、自來水、KMnO4溶液、礦泉水進(jìn)行沖洗，各加入10 ml礦泉水。高劑量組將香煙濾嘴端插入帶有過濾裝置的水煙壺中，點(diǎn)燃香煙由一名志愿者緩慢勻速抽吸，使煙霧以小泡狀通過礦泉水，至2支香煙燃畢，制備香煙煙霧水溶液。低劑量組將制備的香煙煙霧水溶液稀釋1倍。每組溶液中投放5條斑馬魚。觀察1、2、3、5、10內(nèi)斑馬魚的游速、側(cè)翻等行動(dòng)變化及死亡等情況。

1.2.2煙霧水溶物對小鼠急性毒性試驗(yàn)

選出志愿吸煙同學(xué)，吸煙前先將4 ml礦泉水放入清洗過的水煙壺內(nèi)振搖，用注射器抽取1 ml作為對照試驗(yàn)。將香煙插入水煙壺上，點(diǎn)燃香煙吸入，邊吸邊晃動(dòng)，使煙霧融入液體中，此時(shí)，煙內(nèi)的毒物如煙堿等即融入水中。抽完2支煙后，用其含煙堿水溶液給小白鼠行腹腔注射(ip)。

取小鼠9只，隨機(jī)分為3組，每組3只。對照組吸煙前水煙斗內(nèi)液體0.5 ml，ip作為對照；低劑量組吸煙后水煙斗內(nèi)液體0.25 ml+0.25 ml礦泉水，ip；高劑量組注射同樣液體0.5 ml，ip(注射容積均為0.5 ml/只)。觀察10 min內(nèi)各鼠豎尾程度、活動(dòng)頻率、角弓反張等行為變化及死亡等情況。

2 結(jié) 果

2.1煙霧水溶液對斑馬魚急性毒性癥狀

在急性毒性試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚1 min內(nèi)不?？焖儆蝿?dòng)且速度不均勻，2 min開始側(cè)翻、打轉(zhuǎn)，3 min出現(xiàn)游動(dòng)遲緩，5 min出現(xiàn)死亡情況，低劑量在10 min內(nèi)全部死亡，且與劑量成正相關(guān)性；空白對照組5條斑馬魚活動(dòng)情況無明顯改變，均勻游動(dòng)或靜止，無死亡現(xiàn)象(表1)。

2.2香煙煙霧水溶液對小鼠急性毒性癥狀

空白對照組小鼠注射礦泉水后行為均無明顯改變；實(shí)驗(yàn)組小鼠注射香煙煙霧水溶物后在2 min內(nèi)可觀察到豎尾、呼吸困難、全身劇烈抽搐等現(xiàn)象，5～10 min內(nèi)高劑量組均死亡，且與劑量成正相關(guān)(表2)。

表2 香煙煙霧水溶液對小鼠行為的影響(n=3)

3 討 論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究和教學(xué)實(shí)驗(yàn)的載體，所選動(dòng)物其基因應(yīng)接近人類。毒性測定是高校藥理學(xué)必修實(shí)驗(yàn)，各種藥物的毒性測定，如急性毒性、亞急性和慢性、半數(shù)致死量測定等，多選用哺乳動(dòng)物小鼠，但其實(shí)驗(yàn)存在周期長、用藥量大、費(fèi)用高、飼養(yǎng)困難及動(dòng)物福利和倫理等問題。操作簡單、成本低廉、測試周期較短的模式動(dòng)物廣泛用于毒性檢測和評價(jià)。斑馬魚與人類基因相似度達(dá)87%，是國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)推薦使用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物[4]。與其他脊椎動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物小鼠)相比，斑馬魚具有個(gè)體小、便于獲得、養(yǎng)殖條件簡單、繁殖速度快、生命周期短、生長迅速、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)模式生物。魚類對水體中的毒物較為敏感，直接由鰓組織吸收和滯留污染物和毒物，在水體、空氣、食品等毒性監(jiān)測中應(yīng)用廣泛[5-6]。在毒性監(jiān)測方面，我國古代先民早有在水缸中放入魚類檢測毒性的智慧。

斑馬魚和其它魚類均可用于毒性測定[7]。本實(shí)驗(yàn)測定斑馬魚對煙霧水溶液的急性毒性反應(yīng)，并與小鼠急性毒性測定做比較。實(shí)驗(yàn)中將斑馬魚置于不同濃度的煙霧水溶液中，相當(dāng)于模擬人類在短時(shí)間內(nèi)大劑量吸入香煙的情況，用等容量的礦泉水做空白對照，同時(shí)測定煙霧水溶液對小鼠的急性毒性。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與煙霧水溶液對小鼠的急性毒性影響基本一致，證明斑馬魚同樣具備實(shí)驗(yàn)作用，安全有效，為一種良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，斑馬魚體型小，易攜帶，為制造便攜式毒性檢測裝置打下了基礎(chǔ)，適于學(xué)生實(shí)驗(yàn)課程，為實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革提供了新思路。

[1] Vittozzi L, Angelis GD. A critical review of comparative acute toxicity data on freshwater fish[J].Aquatic Toxicology,1991,19(91):167-204.

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[3] 岳旺,張繼國,楊杰,等.斑馬魚—一種新型電驚厥動(dòng)物模型[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào), 2014, 4(6):17-20.

[4] Tsang M．Zebrafish: a tool for chemical screens[J].Birth Defects Research Part C: Embryo Today:Reviews,2010,90(3):185-192.

[5] 張述智, 張述仁,岳旺,等. 一種便攜式糧果蔬及水質(zhì)毒性生物檢測裝置[P].ZL201510219269.3.

[6] 姜?jiǎng)?岳川,岳旺,等.一種便攜式空氣毒性生物檢測裝置[P].ZL 201520276573.7.

[7] 熊婷, 霍文冕, 竇立寶,等. 香煙煙霧水溶液對小草魚急性毒性試驗(yàn)的研究[J]. 環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù), 2010,22(4):27-29.