T-SPOT.TB在菌陰肺結(jié)核中的診斷價值

再吐娜·買買提明 張永花 王淑梅 丁 洋

(塔城地區(qū)人民醫(yī)院，新疆 塔城 834700)

據(jù)世界衛(wèi)生組織估算，全世界有1/3人口感染了結(jié)核病分枝桿菌，每年有900萬新增結(jié)核病患者，約300萬人死于結(jié)核疾病[1]。我國是世界上結(jié)核病高疫情國家之一，結(jié)核病死亡的人數(shù)是其他傳染病死亡人數(shù)的兩倍以上。目前，臨床上主要應(yīng)用影像學(xué)檢查和痰結(jié)核分枝桿菌試驗(yàn)診斷肺結(jié)核。然而痰結(jié)核分枝桿菌檢測特異性不夠高，陽性率低，在明確肺結(jié)核疾病的診斷中存在一定困難。在活動性肺結(jié)核患者中，菌陰肺結(jié)核患者占40%～60%[1]，導(dǎo)致許多患者失去了早診斷、早治療的機(jī)會。近2年來，T-SPOT.TB檢查引入臨床檢測，并在臨床診斷中得到了開展和應(yīng)用，成為結(jié)核感染早期診斷的方法。T-SPOT.TB使用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血單個細(xì)胞，通過細(xì)胞因子γ干擾素的分泌檢測抗原特異性T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，從而判斷結(jié)核感染的狀態(tài)[2]。T-SPOT.TB檢測具備較強(qiáng)特異性和敏感性，在診斷菌陰肺結(jié)核和潛伏期肺結(jié)核中得到了臨床診斷學(xué)的肯定。我院于2016年6月至2017年8月應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)在菌陰肺結(jié)核患者和肺炎患者采取靜脈血進(jìn)行T-SPOT.TB試驗(yàn)，分析比較T-SPOT.TB試驗(yàn)在結(jié)核病診斷的靈敏性和特異性，從而探討T-SPOT.TB在菌陰肺結(jié)核的診斷價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2016年6月—2017年8月于新疆塔城地區(qū)人民醫(yī)院住院的菌陰肺結(jié)核患者156例為實(shí)驗(yàn)組，其中男性91例，女性65例；漢族患者76例，其他民族患者80例，年齡21～80歲，平均年齡(50.5±2.8)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡﹥18歲；(2)符合2008年《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南(2008年版)》[3]中肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近期應(yīng)用抗結(jié)核治療的患者；(2)痰結(jié)核分枝桿菌陽性，明確診斷的患者。選取2016年6月—2017年8月于新疆塔城地區(qū)人民醫(yī)院住院的肺炎患者144例為實(shí)驗(yàn)組，其中男性69例，女性75例；漢族患者74例，其他民族患者70例，年齡18～80歲，平均年齡(50±2.5)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡﹥18歲；(2)經(jīng)過各項(xiàng)輔助檢查明確肺炎，排除肺結(jié)核的患者。

1.2研究方法

1.2.1一般資料收集 記錄患者性別、年齡、族別、吸煙及飲酒情況、基礎(chǔ)疾病(呼吸系統(tǒng)以外的疾病)、既往病史、是否接受過抗結(jié)核治療、病理類型(繼發(fā)性肺結(jié)核、粟粒型肺結(jié)核、胸腔積液、淋巴結(jié)核)等。各項(xiàng)輔助檢查(痰結(jié)核分枝桿菌檢測、T-SPOT.TB、結(jié)核抗體、血沉)等。治療方案(抗結(jié)核治療、單純抗炎治療、診斷性抗結(jié)核治療)等。

1.2.2樣品采集 采集患者外周靜脈血5 ml，與室溫RPM11640不完全培養(yǎng)液按照1∶1的比例混合均勻，將分離出的單個細(xì)胞層移植到干燥清潔的離心管中，取細(xì)胞懸液10 μl和0.4%細(xì)胞稀釋液40 μl加入細(xì)胞計數(shù)板并進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。

1.2.3培養(yǎng)板的設(shè)置 取出培養(yǎng)板并加入50 μl AIM-V無血清培養(yǎng)液、50 μl抗原A、抗原B和50 μl陽性對照，于37°C下放入5%CO2培養(yǎng)箱孵育20 h。

1.2.4斑點(diǎn)計數(shù) 取出培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)板，棄去孔內(nèi)的液體后，清洗干凈小孔，各小孔內(nèi)加入50 μl新鮮配制的酶標(biāo)抗體溶液，在2～8°C孵育1 h再加入50 μl底物溶液在室溫反應(yīng)7 min，蒸餾水沖洗后進(jìn)行2～3 h干燥處理，然后在ELISPOT自動計數(shù)儀下斑點(diǎn)進(jìn)行計數(shù)。

1.2.5結(jié)果判定 根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)確定檢測結(jié)果的陽性與陰性比例。陰性對照斑點(diǎn)數(shù)0～5個，任何一個檢測孔計數(shù)減去陰性孔計數(shù)≥6判斷為陽性。如果陰性對照斑點(diǎn)數(shù)≥6，檢測孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)，判定為陽性。

1.3結(jié)核抗體檢測 采集患者左手無名指內(nèi)側(cè)末梢血液，棄去第1滴血液，采集第2滴血液10 μl，切勿過度擠壓，混入組織液。將微量采血管中的末梢血快速加入加樣孔中，同時加入2滴約100 μl稀釋液，進(jìn)行觀察。陽性結(jié)果：在觀察窗T、C處先后出現(xiàn)紫紅色線；陰性結(jié)果：僅在觀察窗C處出現(xiàn)紫紅色線；無效：在觀察窗T、C處無紫紅色線出現(xiàn)。

1.4結(jié)核菌涂片 收集患者痰液涂在玻璃片上自然陰干，在碳酸品紅溶液中加入tergito17后染色，涂色時間不低于10 min，置入顯微鏡下觀察，找到抗酸染色桿菌為陽性。

1.5紅細(xì)胞沉降率(ESR)測定 采集患者外周靜脈血2 ml注入含有3.8%枸櫞酸鈉0.4 ml抗凝采血管內(nèi)充分混勻，用魏氏血沉管吸血到0刻度，并直立于血沉架上1 h，沉降管應(yīng)垂直豎立，不能傾斜，觀察紅細(xì)胞下降的毫米數(shù)。結(jié)果判定男性﹤15 mm/h 女性﹤20 mm/h為診斷數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者輔助實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)比較 兩組患者均為痰結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)陰性的患者，兩組患者均實(shí)施結(jié)核抗體三項(xiàng)、血沉及T-SPOT.TB檢測。(T-SPOT.TB檢測包括干擾素測定A、干擾素測定B、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、干擾素測定AIM-V 4個項(xiàng)目指標(biāo))。結(jié)果顯示T-SPOT.TB檢測和結(jié)核抗體檢測有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，均為實(shí)驗(yàn)組陽性率高于對照組。見表1。

表1 兩組患者實(shí)驗(yàn)室輔助診斷檢查結(jié)果比較(例，%)

2.2T-SPOT.TB與其他輔助檢查診斷指標(biāo)的比較 血沉的95%置信區(qū)間包含0.5，故這項(xiàng)檢查無結(jié)核病診斷價值。T-SPOT.TB與結(jié)核抗體三項(xiàng)診斷價值的比較結(jié)果為：AUCT-SPOT.TB與AUC結(jié)核抗體三項(xiàng)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=3.879，P<0.001)，AUCT-SPOT.TB大于AUC結(jié)核抗體三項(xiàng)，說明T-SPOT.TB診斷結(jié)核病的價值高于結(jié)核抗體三項(xiàng)。見表2。

表2 T-SPOT.TB與其他輔助檢查診斷指標(biāo)的比較

2.3Logistic回歸模型多指標(biāo)診斷與T-SPOT.TB診斷結(jié)核病的比較 多指標(biāo)診斷采用Logistic回歸建立模型(逐步前進(jìn)法，取α進(jìn)入=0.05，α剔除=0.10)，以患者性別、年齡、民族、職業(yè)、飲酒史、吸煙史、既往疾病史、既往結(jié)核病史、結(jié)核接觸史、影像學(xué)肺部陳舊結(jié)核病灶、合并肺外結(jié)核病與T-SPOT.TB建立多指標(biāo)診斷模型，結(jié)果顯示既往結(jié)核病史結(jié)合T-SPOT.TB有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表3。

表3 多因素Logistic回歸模型結(jié)果

2.4T-SPOT.TB與Logistic回歸的ROC曲線 曲線下面積AUCLogistic=0.937。T-SPOT.TB與Logistic回歸模型的ROC曲線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=3.621，P=0.009)，AUCLogistic大于AUCT-SPOT.TB。即T-SPOT.TB聯(lián)合既往結(jié)核病史的診斷價值更高，但T-SPOT.TB仍然可以獨(dú)立診斷肺結(jié)核，其實(shí)用價值優(yōu)于Logistic回歸。見圖1。

圖1 三聯(lián)檢測指標(biāo)ROC曲線

3 討 論

結(jié)核病是威脅全球公共衛(wèi)生的嚴(yán)重傳染病之一。我國結(jié)核病的人數(shù)位于全世界第二位，每年約有新增病例150萬人，死亡13萬人，已經(jīng)成為全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一。因此，快速準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病對結(jié)核的防控至關(guān)重要。

T-SPOT.TB試驗(yàn)是一種利用人外周血單核細(xì)胞在結(jié)核特異性抗原ESAF6和CFP-10的刺激下釋放IFN-R,通過免疫斑點(diǎn)數(shù)來確診結(jié)核的方法?？姾７錥4]研究報道，T-SPOT.TB試驗(yàn)的靈敏度和特異度均可達(dá)到90%以上。本次研究結(jié)果顯示，T-SPOT.TB診斷菌陰肺結(jié)核靈敏度為95.5%、特異度為89.6%。靜脈血液中結(jié)核特異性釋放IFN-R的T淋巴細(xì)胞，不會受到個體細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果的影響，在診斷菌陰肺結(jié)核中T-SPOT.TB檢測更有輔助診斷價值。

結(jié)核抗體試驗(yàn)是一種以純化結(jié)核分枝干菌、胞壁蛋白38KD抗原，檢測血清中相應(yīng)的LgG抗體，由于38KD蛋白抗原定位在質(zhì)膜上，屬于脂蛋白，能夠在刺激B細(xì)胞的作用下產(chǎn)生抗體[5]。本研究中T-SPOT.TB的靈敏度和特異度高于結(jié)核抗體檢測，與國外文獻(xiàn)[6]報道一致。結(jié)果顯示，T-SPOT.TB在診斷肺結(jié)核中有較高的診斷價值，如果聯(lián)合結(jié)核抗體檢測，具有更高的應(yīng)用價值。

肺結(jié)核疾病的診斷，通常是根據(jù)患者的癥狀、影像學(xué)檢查和痰結(jié)核分枝桿菌試驗(yàn)來明確診斷。但是，由于痰結(jié)核分枝桿菌試驗(yàn)特異度和敏感度不高，給診斷肺結(jié)核帶來一些困難。本研究顯示，菌陰肺結(jié)核的患者中，T-SPOT.TB結(jié)合既往結(jié)核病史、結(jié)核病接觸史、影像學(xué)檢查對診斷肺結(jié)核有較高的應(yīng)用價值。根據(jù)T-SPOT.TB與Logistic回歸模型的ROC曲線示，T-SPOT.TB在臨床診斷中也有較高的獨(dú)立診斷價值。

綜上所述，T-SPOT.TB技術(shù)在菌陰肺結(jié)核的診斷中有良好的應(yīng)用價值，其敏感度和特異度較高，在臨床中對疑似肺結(jié)核患者進(jìn)行T-SPOT.TB檢測，能顯著提高肺結(jié)核的診斷率，減少臨床誤診率，值得臨床推廣和應(yīng)用。

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