一種pH響應性納米粒對牙周菌斑生物膜的抑制作用及生物相容性評價

(青島大學附屬醫(yī)院牙周病科，山東 青島 266003)

牙周炎是目前全球范圍內最普遍的慢性疾病之一[1-2]。該病人群患病率較高，且往往在晚期才會被診斷出來，因此嚴重影響患者的生活質量，并給患者增加極大的經濟負擔。而引起牙周炎的始動因素便是菌斑生物膜(菌膜)[3-4]。菌膜微環(huán)境具有獨特的特征，其pH值可以達到4.5，甚至更低[5]，此外表面帶有大量的負電荷[6]，因此，設計一種靶向性的能夠吸附在菌膜表面并且對菌膜的低 pH環(huán)境有響應性的納米粒子，是破壞菌膜、殺死菌膜內菌體的有效方式。季銨鹽殼聚糖是殼聚糖的衍生物，因帶有永久的正電荷而使其本身具有較高的抑菌活性[7]。脂質體是一種帶負電囊泡狀結構的生物材料，具有與多種物質結合的能力，被廣泛作為藥物輸送載體[8]。本實驗選擇治療牙周病的首選藥物鹽酸多西環(huán)素作為模型藥物[9]，以帶負電荷脂質體作為藥物載體，并以正電性的季銨鹽殼聚糖作為納米粒外殼旨在制備具有pH響應性的季銨鹽脂質體多西環(huán)素納米粒(TMC-Lip-DOX NPs)，通過牙周炎的厭氧菌體外抑菌試驗測試TMC-Lip-DOX NPs的抑菌活性，通過牙周膜成纖維細胞測試其細胞相融性。從而探討該具有pH響應性的TMC-Lip-DOX NPs作為口腔臨床用藥的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料來源

殼聚糖(相對分子質量為150 000，脫乙酰度為85%)及蛋黃卵磷脂購自山東萊州海利生物制品有限公司。碘甲烷(CH3I)、二甲亞砜(DMSO)、氫氧化鈉(NaOH)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自青島云山生物科技有限公司。牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalisATCC33277)、中間普氏菌(P.intermediaATCC25611)和伴放線放線桿菌(A.actinomycetemcomitansY4)由中國海洋大學微生物學實驗室提供。牙周膜成纖維細胞(HPDLFs)由青島大學細胞實驗室提供。噻唑藍(MTT)和研究中的其他化學試劑購自青島華盛化學試劑公司。SD大鼠購買自上海斯萊克有限公司。

1.2 pH響應性納米粒的合成及其表征

1.2.1季銨鹽殼聚糖的制備 季銨鹽殼聚糖是在堿性的條件下將殼聚糖進行甲基化作用而合成的[10-11]。稱取2 g殼聚糖粉末加入到40 mL二甲亞砜和6 mL NaOH(150 g/L)的混合溶液中，在室溫條件下攪拌一定的時間，然后加入12 mL的碘甲烷，60 ℃下反應1 h。1 h后，再往燒瓶中加入適量的150 g/L的NaOH和CH3I，使其徹底反應。反應結束后，加入無水乙醇出現(xiàn)白色沉淀后終止反應，透析、凍干。即得水溶性的季銨鹽殼聚糖。

1.2.2脂質體的制備 脂質體采用薄膜蒸發(fā)法制得[12]。稱取質量70 mg的蛋黃卵磷脂，加入體積比為1∶1的三氯甲烷和無水乙醇溶解，在35 ℃減壓的條件下蒸發(fā)干燥至形成均勻薄膜。加入5 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，其中溶有25 mg膽酸鈉和5 mg多西環(huán)素，在55 ℃的水浴中旋轉攪拌30 min，冰浴下超聲4次后，得到脂質體納米粒混懸液。而且，水化過后，1 g/L的多西環(huán)素被包含在脂質體囊泡中。

1.2.3TMC-Lip-DOX NPs制備 將0.5 g/L的季銨鹽殼聚糖溶液緩慢滴加到等體積包載多西環(huán)素脂質體乳液中，滴加完成后繼續(xù)攪拌一定時間，超聲后得到TMC-Lip-DOX NPs。

1.2.4TMC-Lip-DOX NPs粒徑大小、分布情況和形態(tài)檢測 使用激光粒度/Zeta電位分析儀分別測定游離脂質體(A組)、pH 7.2環(huán)境下的季銨鹽脂質體(B組)、pH 4.5環(huán)境下的季銨鹽脂質體(C組)和pH 7.2環(huán)境下的TMC-Lip-DOX NPs(D組)的粒徑大小及分布情況，并在透射電子顯微鏡下觀察納米粒形態(tài)。

1.3 菌斑生物膜的形成

將牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和伴放線放線桿菌分別置于TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)待用。隨后將3種菌液等體積混合后再用培養(yǎng)基將混合后的菌液稀釋至1×109CPU/L，并滴加至放有羥基磷灰石片的6孔板內，并于37 ℃嚴格厭氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h[13]，羥基磷灰石片上即得混合菌斑生物膜。

1.4 TMC-Lip-DOX NPs對游離混合菌抑菌活性

采用MTT法檢測納米粒對游離混合菌的抑菌活性。將牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和伴放線放線桿菌混合后的菌液稀釋至1×108CPU/L。取200 μL稀釋后的細菌懸液分別與等體積的培養(yǎng)基溶液(A組)、季銨鹽溶液(B組)、多西環(huán)素溶液(C組)、季銨鹽脂質體溶液(D組)和TMC-Lip-DOX NPs溶液(E組)混合，并分別滴加至96孔板中培養(yǎng)24 h。隨后加入含0.5 g/L 的MTT的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基后加入100 μL的DMSO，10 min后用酶標儀在波長492 nm處測定其吸光度(A)值。以相同方法重復該實驗3次。

1.5 TMC-Lip-DOX NPs對菌斑生物膜抑菌效果

待羥基磷灰石片上的菌斑生物膜形成后，去除6孔板內的菌液并分別加入2 mL的PBS緩沖液(A組)、季銨鹽溶液(B組)、多西環(huán)素溶液(C組)以及TMC-Lip-DOX NPs溶液(D組)共培養(yǎng)24 h。隨后用5-DTAF對菌斑生物膜進行染色，并用熒光顯微鏡對其生物膜進行觀察。同樣以相同方法重復該實驗3次，觀察結果。

1.6 細胞相容性檢測

選用HPDLFs體外以MTT法檢測TMC-Lip-DOX NPs細胞相融性[14]。將密度為1×108個/L的細胞接種于96孔板內培養(yǎng)12 h后，棄去原液，用PBS洗滌2次后，分別更換為含體積分數(shù)0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5和0.031 25的TMC-Lip-DOX NPs，繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。陰性對照組加入相同體積的空白培養(yǎng)基。隨后，每孔加入10 μL濃度為5 g/L的MTT液，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中反應4 h。棄去培養(yǎng)基以后加入150 μL DMSO溶解10 min，使甲瓚晶體完全溶解，采用紫外分光光度計檢測波長490 nm處的吸光度(A)值。相對生長速率用以下方程式表示：相對生長速率(%)=Dt/Dnc×100%，Dt和Dnc分別指測試樣品的吸光度值和陰性對照的吸光度值。

1.7 TMC-Lip-DOX NPs體內毒性實驗[15]

選取20只大鼠(雌雄各半)，體質量為(152.6±18.4)g，隨機分成對照組和實驗組(n=10)。實驗組單次灌胃10 mL/kg的TMC-Lip-DOX NPs溶液，對照組單次灌胃相同劑量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。隨時記錄大鼠的行為活動狀態(tài)，觀察是否有呼吸困難、腹瀉、眼瞼下垂等中毒癥狀或死亡。1周后頸部脫臼法處死大鼠，并完整取出其心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，浸泡在40 g/L中性甲醛溶液中，24 h后脫水、包埋、切片、HE染色。在光學顯微鏡下觀察組織有無病理改變。

2 結 果

2.1 TMC-Lip-DOX NPs的表征

從外觀上看，合成的TMC-Lip-DOX NPs為乳白色渾濁液體(圖1A)，超聲后略變澄清(圖1B)。透射電鏡觀察粒子的形態(tài)并拍攝照片，包載多西環(huán)素的脂質體為類圓形，季銨鹽包裹后使部分脂質體聚集在一起，直徑明顯增大(圖2)。采用激光粒度/Zeta電位分析儀測量的不同成分納米粒及納米粒不同pH環(huán)境下的直徑、分散系數(shù)和電動電位的結果如表1所示。在同一pH值環(huán)境下(pH 7.2)，覆蓋上季銨鹽后(季銨鹽脂質體納米粒)直徑明顯增大,電位升高(B組)。當改變pH環(huán)境(pH 4.5)，季銨鹽脂質體納米粒電位反轉為正電荷,并且隨著pH值的降低，納米粒的直徑增加(C組)。在pH為7.2的環(huán)境下，加載多西環(huán)素得到的TMC-Lip-DOX NPs(D組)，其直徑有了顯著增大(F=36.98,P<0.01)，電位有了顯著增高(F=39.88，P<0.01)，而各組之間的分散系數(shù)無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.2 TMC-Lip-DOX NPs對游離混合菌的抑菌活性

對各實驗分組的吸光值數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，A、B、C、D、E組的吸光值分別為1.64±0.13、1.27±0.19、0.99±0.23、1.34±0.15、0.48±0.04，與A組相比，季銨鹽、多西環(huán)素、季銨鹽脂質體、TMC-Lip-DOX NPs均有不同程度的抑菌效果，不同組的藥物對相同混合菌的抑菌效果比較差異具有顯著性(F=49.87)，其中TMC-Lip-DOX NPs的抑菌效果優(yōu)于其他3種(P<0.01)。

圖1 TMC-Lip-DOX NPs形態(tài)外觀

A：80 kV,25 000倍，B：80 kV,150 000倍。

分組粒徑(D/nm)分散系數(shù)電位(V/mV)A組103．2±3．50．19±0．10-22．23±1．07B組128．9±3．20．29±0．12-10．08±1．02C組158．0±3．00．17±0．07 9．32±0．63D組172．0±3．60．22±0．06 13．35±1．02

2.3 TMC-Lip-DOX NPs對于菌斑生物膜的抑菌效果

羥基磷灰石片與混合細菌共同培養(yǎng)24 h以后，5-DTAF染色后封片觀察，菌斑生物膜24 h后形成，未經處理的生物膜作為A組(圖3A)。季銨鹽、多西環(huán)素和TMC-Lip-DOX NPs的抗菌性能具有顯著差異。B、C組雖生物膜結構受到一定程度的破壞，但結構仍然存在，未徹底分解，而C組破壞程度明顯大于B組(圖3B、C)。D組生物膜的結構明顯破壞，細菌數(shù)量顯著減少，只有少量的游離細菌存在(圖3D)。

2.4 細胞相容性檢測

24 h條件下不同濃度TMC-Lip-DOX NPs作用下的細胞相對的生長速率分別為80.60%、88.14%、89.32%、98.88%、99.56%，48 h條件下不同濃度TMC-Lip-DOX NPs作用下的細胞相對生長速率分別為85.67%、87.90%、94.22%、98.10%、99.38%。不同濃度的TMC-Lip-DOX NPs作用下在不同時間段的細胞相對生長速率與陰性對照組比較差異均無顯著性(P>0.05)。

2.5 急性毒性檢測

連續(xù)1周灌胃給藥后，實驗組與對照組大鼠行為狀態(tài)良好，均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，病理檢查各組大鼠的各內臟器官，未發(fā)現(xiàn)明顯異常(圖4)。

A、B、C、D分別為A、B、C、D組。5-DTAF染色，10倍。

A、B、C、D、E分別代表對照組的心、肝、脾、肺、腎，A′、B′、C′、D′、E′分別代表實驗組的心、肝、脾、肺、腎。HE染色，200倍。

3 討 論

本實驗以帶負電荷脂質體作為包載多西環(huán)素的核心載體，使用季銨化修飾得到的正電性季銨鹽殼聚糖作為納米粒外殼，季銨鹽與脂質體間通過靜電吸附作用而相互交聯(lián)，從而形成了具有pH響應性的TMC-Lip-DOX NPs。當納米粒通過電荷作用黏附在菌膜上，處于菌膜獨特的低pH環(huán)境時，季銨鹽殼聚糖中未進行季銨化反應的游離氨基發(fā)生質子化反應，從而使納米粒外殼攜帶更多的正電荷，因而降低了納米粒的穩(wěn)定性而激發(fā)了脂質體內多西環(huán)素在菌膜病灶處迅速釋放，以達到破壞菌膜，殺死病原菌的目的。

本實驗結果顯示，TMC-Lip-DOX NPs在水溶液中分散均勻，呈近似圓形，脂質體外包裹季銨鹽后粒徑明顯變大，一方面，季銨鹽包裹在脂質體外，增加了其原本的直徑，另一方面，具有長鏈的陽離子TMC可以交聯(lián)多個脂質體形成更大的顆粒[16]。當外界溶液中pH值降低時，納米粒由原本的負電荷反轉為正電荷，且粒徑也隨之增大。分析其原因是，當pH值降低后，脂質體外層的季銨鹽發(fā)生質子化，使其表面帶有更多正電荷，因而交聯(lián)更多脂質體，使得納米粒的直徑明顯變大。

殼聚糖是天然的陽離子多糖，具有安全無毒、生物可降解的特點[17]。將殼聚糖進行季銨化修飾能明顯增強其水溶性和抑菌性，并能夠攜帶永久正電荷，因而季銨基團修飾的殼聚糖的抗菌活性高于傳統(tǒng)殼聚糖[18]。我們的實驗分析結果表明，使用改性殼聚糖作為納米粒外殼，能夠顯著地提高納米粒對菌膜的黏附性，并大大提高藥物的抑菌效率。針對TMC-Lip-DOX NPs對生物膜的作用機制，我們可歸納為三方面。第一，正電荷納米粒能通過靜電吸附作用聚集在帶負電荷的細菌生物膜表面[19-20]。第二，抗菌納米顆粒能有效滲透進入菌斑生物膜，導致細胞膜解體，細胞質內容外泄，最終導致細胞死亡。生物膜具有胞外聚合物作為保護性矩陣，可以獲得對傳統(tǒng)抗生素的耐藥性，并阻止各種治療劑的有效傳遞[21-23]。第三，季銨鹽可以作為一種有效抑菌劑作用于菌膜內的胞外聚合物，導致菌斑生物膜結構破壞。這將促進多西環(huán)素對細菌的抑菌作用。

對于TMC-Lip-DOX NPs的安全性試驗，我們進行了初步的研究，其中細胞相溶性實驗和急性毒性實驗是比較常用的實驗方法[24-26]，用于避免材料應用于人體后出現(xiàn)嚴重的不良反應。本實驗結果顯示,各實驗組細胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞相對生長速率沒有顯著性降低,形態(tài)良好,各不同濃度的TMC-Lip-DOX NPs組在各時間段相對生長速率與陰性對照組無顯著差異，表明TMC-Lip-DOX NPs與牙周膜成纖維細胞具有良好的細胞相容性。而病理結果表明，其對大鼠也無明顯的致毒作用，可初步說明此材料具有一定的安全性。對于臨床應用具有一定的指導作用。

綜上，本實驗制得的TMC-Lip-DOX NPs粒徑較小，具有較強的抑菌作用，毒性小，大大提高了抗生素在體內的作用效率，從而有助于減少臨床中抗生素的濫用，具有廣泛的應用前景。

[1] SAKANAKA A, KUBONIWA M, HASHINO E, et al. Distinct signatures of dental plaque metabolic byproducts dictated by periodontal inflammatory status[J]. Sci Rep, 2017,7:42818.

[2] KOPYTYNSKA-KASPERCZYK A, DOBRZYNSKI P, PASTUSIAK M, et al. Local delivery system of doxycycline hyclate based on epsilon-caprolactone copolymers for periodontitis treatment[J]. Int J Pharm, 2015,491(1-2):335-344.

[3] 劉驍,李禹. 牙周炎的病因及危險因素的相關研究進展[J]. 中國實用醫(yī)藥, 2009,4(24):99-100.

[4] 魯純,胡凡,徐艷,等. 菌斑生物膜原位干預模型的建立[J]. 口腔醫(yī)學, 2009,29(4):174-176.

[5] KOO H, FALSETTA M L, KLEIN M I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm [J]. J Dent Res, 2013,92(12):1065-1073.

[6] HOREV B, KLEIN M I, HWANG G, et al. pH-Activated nanoparticles for controlled topical delivery of farnesol to disrupt oral biofilm virulence[J]. ACS Nano, 2015,9(3):2390-2404.

[7] QIN C, XIAO Q, LI H, et al. Calorimetric studies of the action of chitosan-N-2-hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride on the growth of microorganisms[J]. Int J Biol Macromol, 2004,34(1-2):121-126.

[8] BOZZUTO G, MOLINARI A. Liposomes as nanomedical devices[J]. Int J Nanomedicine, 2015:975.

[9] 蘆潔,祝林,金鴻萊,等. 鹽酸多西環(huán)素脂質體凝膠劑的制備與評價[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2006,37(2):93-95.

[10] XU T, XIN M, LI M, et al. Synthesis, characterization, and antibacterial activity of N,O-quaternary ammonium chitosan[J]. Carbohydr Res, 2011,346(15):2445-2450.

[11] JIN Y, SONG Y, ZHU X, et al. Goblet cell-targeting nano-particles for oral insulin delivery and the influence of mucus on insulin transport[J]. Biomaterials, 2012,33(5):1573-1582.

[12] KONG M,HOU L, WANG J, et al. Enhanced transdermal lymphatic drug delivery of hyaluronic acid modified transfersomes for tumor metastasis therapy[J]. Chem Commun (Camb), 2015,51(8):1453-1456.

[13] 李永凱,段丁瑜,趙蕾,等. 牙周菌斑生物膜的體外模型建立[J]. 國際口腔醫(yī)學雜志, 2012,39(1):37-42.

[14] 楊楊,季娟娟,彭蓓,等. 4種鑄造合金對人牙齦成纖維細胞的毒性研究[J]. 實用口腔醫(yī)學雜志, 2009,25(1):84-87.

[15] 張冬華,車向新,李衛(wèi)東.自制 CPC 納米復合材料溶血試驗和短期全身毒性試驗的研究[J]. 南昌大學學報(醫(yī)學版), 2010,50(5):9-12.

[16] FANG B, JIANG Y, NUSSLEIN K, et al. Antimicrobial surfaces containing cationic nanoparticles: How immobilized, clustered, and protruding cationic charge presentation affects killing activity and kinetics[J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2015,125:255-263.

[17] 梁麗媚,李思東,李程鵬,等. 殼聚糖及其衍生物抗菌活性的研究進展[J]. 廣州化工, 2017,45(20):6-9.

[18] WIARACHAI O, THONGCHUL N, KIATKAMJORNWONG S, et al. Surface-quaternized chitosan particles as an alternative and effective organic antibacterial material[J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2012,92:121-129.

[19] NG V W, KE X, LEE A L, et al. Synergistic co-delivery of membrane-disrupting polymers with commercial antibiotics against highly opportunistic bacteria[J]. Adv Mater, 2013,25(46):6730-6736.

[20] ALLAKER R P. The use of nanoparticles to control oral biofilm formation[J]. J Dent Res, 2010,89(11):1175-1186.

[21] Harvey J D. Periodontal microbiology[J]. Dent Clin North Am, 2017,61(2):253-269.

[22] DUNCAN B, LI X, LANDIS R F, et al. Nanoparticle stabilized capsules for the treatment of bacterial biofilms[J]. Acs Nano, 2015,9(8):7775.

[23] JONGSMA M A, VAN DER MEI H C, ATEMA-SMIT J, et al. In vivo biofilm formation on stainless steel bonded retainers during different oral health-care regimens[J]. Int J Oral Sci, 2015,7(1):42-48.

[24] 鄧婧,劉夢東,許曉燕,等. 復方牡蠣根管充填糊劑的體外細胞毒性研究[J]. 上?？谇会t(yī)學, 2007,16(4):410-412.

[25] 朱文軍,程祥榮,潘杏蘭,等. 新型羥基磷灰石涂層鈦種植材料生物安全性的初步評價[J]. 口腔材料器械雜志, 2004,13(3):122-124.

[26] 張長源,程輝,王希,等. 反復熔鑄Ni-Cr烤瓷合金體外細胞毒性實驗(MTT法)[J]. 實用口腔醫(yī)學雜志, 2010,26(3):306-309.