BRAF VE1抗體在檢測結(jié)直腸癌BRAF V600E基因突變中的應(yīng)用

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科,山東 青島 266003)

BRAF基因是RAF家族成員，其基因突變可以激活下游的信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細胞增殖與調(diào)節(jié)功能紊亂，從而促進腫瘤的發(fā)生[1-2]。研究顯示結(jié)直腸癌中BRAF的突變率為5%～20%，其中90%以上為V600E突變[3-4]。BRAF V600E不僅是散發(fā)性微衛(wèi)星不穩(wěn)定性結(jié)直腸癌的重要標(biāo)記物[5-6]，且其與結(jié)直腸癌病人預(yù)后相關(guān)[7-8]，并能預(yù)測靶向藥物的療效[9-11]。因此，對BRAF突變進行準(zhǔn)確和快速檢測，對結(jié)直腸癌病人的診斷及治療有著重要的意義。大量研究表明，BRAF VE1免疫組化抗體檢測甲狀腺乳頭狀癌及黑色素瘤中BRAF V600E基因突變具有較高的靈敏度及特異度[12-14]。而目前關(guān)于BRAF VE1抗體檢測結(jié)直腸癌中BRAF V600E基因突變的研究結(jié)果卻存在很大的爭議，主要表現(xiàn)在特異度較低[15]、癌組織的非特異性的細胞核及正常腺體著色[16-17]。而且其優(yōu)化的染色條件也需要進一步研究。本實驗采用全自動免疫組化染色儀探討合適的BRAF VE1抗體免疫組化染色條件，并評估免疫組化方法檢測結(jié)直腸癌BRAF V600E基因突變的診斷靈敏度和特異度?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機收集我院病理科2014—2016年接受手術(shù)治療的116例原發(fā)性結(jié)直腸癌病人的標(biāo)本。病人手術(shù)前均未行放化療及靶向治療；標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)病理診斷確診。

1.2 免疫組化染色及判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1免疫組化染色 標(biāo)本經(jīng)40 g/L中性緩沖甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片。采用Benchmark XT(Roche公司)全自動免疫組化儀對切片進行BRAF V600E(鼠單克隆，克隆號VE1，貨號790-4855，Roche公司)免疫組化染色。具體步驟：切片72 ℃脫蠟4 min，氧化抑制4 min，然后以EDTA緩沖液(pH 8.0) 99 ℃抗原修復(fù)32 min(其中4例經(jīng)過測序證實V600E狀態(tài)的標(biāo)本，包括2例BRAF V600E突變型，2例BRAF V600E野生型，抗原修復(fù)時間分別為24、32、40、48、56和64 min，并采用抗BRAF V600E(VE1)鼠單克隆抗體進行BRAF V600E蛋白檢測)；OptiView HRP Linker孵育12 min；然后OptiView HRP multimer再孵育12 min；蘇木素染色4 min、藍化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。

1.2.2免疫組化染色判斷標(biāo)準(zhǔn) 陰性(-)：腫瘤細胞胞漿無著色；弱陽性(+)：腫瘤細胞胞漿呈淡黃色；中等陽性()：腫瘤細胞胞漿呈黃色；強陽性()：腫瘤細胞胞漿呈棕褐色[16]。

1.3 DNA提取

選取與免疫組化同一個石蠟包埋標(biāo)本8 μm厚切片5張，根據(jù)DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司，貨號DP305)說明書提取基因組DNA。

1.4 ARMS法檢測BRAF V600E基因突變

加入DNA模板的量及反應(yīng)條件均按人BRAF突變檢測試劑盒(上海源奇生物科技有限公司，貨號CB300026M)說明書要求，最終反應(yīng)結(jié)果按其提供的判斷標(biāo)準(zhǔn)確定標(biāo)本BRAF基因突變狀態(tài)。

1.5 Sanger測序檢測BRAF V600E基因突變

檢測用引物序列如下，F(xiàn):5′-TCATCCTAACA-CATTTCAAGCC-3′,R:5′-GTAAAACGACGGC-CAGTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAA-3′。DNA擴增以及測序按照BRAF V600E基因突變檢測試劑盒(上海源奇生物科技有限公司，貨號CB-300026M)說明書進行操作。應(yīng)用ABI3500Dx配套的軟件系統(tǒng)Sequencing 5.4分析測序的結(jié)果，與BRAF V600E基因組DNA序列(HGNC:1097)進行對比，確定有無突變。

2 結(jié) 果

2.1 最佳抗原修復(fù)時間

本研究4例經(jīng)Sanger測序證實V600E狀態(tài)的標(biāo)本，在24、32、40、48、56和64 min的抗原修復(fù)時間下用全自動免疫組化儀進行染色。結(jié)果顯示，修復(fù)時間32 min時，染色效果最好，定位準(zhǔn)確，非特異性著色少見(圖1A～L)。

2.2 免疫組化及ARMS法檢測BRAF V600E結(jié)果的比較

免疫組化結(jié)果示，116例結(jié)直腸癌組織中，4例BRAF V600E蛋白陽性表達，其中強陽性1例，中等陽性2例，弱陽性1例；陰性表達112例(圖2A～D)。ARMS方法檢測的結(jié)果顯示，3例為BRAF V600E突變型，該3例標(biāo)本免疫組化檢測顯示為中等陽性以及強陽性，而免疫組化為弱陽性的標(biāo)本，ARMS檢測為BRAF野生型。免疫組化陰性的標(biāo)本，ARMS法也均為陰性。將4例免疫組化陽性的標(biāo)本用Sanger測序法進行驗證，結(jié)果與ARMS檢測結(jié)果相同，即免疫組化弱陽性表達的組織證實為野生型，其余3例為V600E突變型。與基因檢測法比較，結(jié)直腸癌中BRAF V600E免疫組化法診斷的靈敏度為100%(3/3)，診斷特異度為99.1%(112/113)，陽性預(yù)測值為75%(3/4)，陰性預(yù)測值為100%(112/112)。兩種方法檢測結(jié)果的一致性為99.1%(115/116)。

3 討 論

目前檢測BRAF基因突變最常用的檢測方法是ARMS-PCR法和Sanger測序法等[18]。由于分子檢測需要提取腫瘤組織的DNA，不僅成本高，而且費時費力，更需要專門的實驗室、專業(yè)儀器及嚴格的質(zhì)量控制[10-19]。相比于以上方法，免疫組化技術(shù)具有穩(wěn)定、快速、敏感、易于質(zhì)控等優(yōu)勢，因此利用免疫組化對BRAF基因突變進行檢測具有良好的應(yīng)用前景[20-21]。

本實驗用全自動免疫組化染色儀探討結(jié)直腸癌組織最佳的BRAF VE1抗體免疫組化染色條件，然后對116例結(jié)直腸癌組織進行BRAF免疫組化染色和分子檢測，評估免疫組化診斷的靈敏度的和特異度。結(jié)果顯示VE1抗體檢測BRAF V600E基因突變最適宜的抗原修復(fù)時間為32 min。在此條件下對結(jié)直腸癌組織進行BRAF V600E免疫組化檢測，其診斷的靈敏度可達100%，特異度達99.1%，免疫組化和分子檢測一致性高達99.1%。而且，國外研究顯示，單純手工染色，也能使免疫組化獲得良好的表達效果[16]。因此，在沒有分子實驗室的基層病理科，只要嚴格控制免疫組化的條件，免疫組化可以作為初步篩查BRAF V600E的良好手段。

A～F:24、32、40、48、56和64 min修復(fù)時間時結(jié)直腸癌BRAF V600E突變型標(biāo)本免疫組化染色情況；G～L:24、32、40、48、56和64 min修復(fù)時間時結(jié)直腸癌BRAF V600E野生型標(biāo)本免疫組化染色情況。免疫組化染色法，200倍。

圖1不同抗原修復(fù)時間結(jié)直腸癌BRAFV600E標(biāo)本免疫組化染色情況

A:陰性染色標(biāo)本；B:弱陽性染色標(biāo)本；C:中等陽性染色標(biāo)本；D:強陽性染色標(biāo)本。免疫組化染色法，200倍。

研究表明，BRAF免疫組化需要嚴格的組織前處理條件和染色條件，如固定劑、固定時間和抗原修復(fù)液的pH值[16,22-23]。有研究證實，VE1抗體修復(fù)液最適合的pH值為8.0[16,24]。但是對于抗原修復(fù)的時間，還沒有明確研究報道。本研究結(jié)果顯示，Benchmark XT全自動免疫組化儀進行腸癌組織BRAF染色最佳的修復(fù)時間是32 min，低于我們科室甲狀腺乳頭狀癌的修復(fù)時間(64 min)。如果應(yīng)用甲狀腺乳頭狀癌組織的免疫組化程序(抗原修復(fù)64 min)對腸癌組織進行染色，其非特異性著色會增加。來自南方醫(yī)科大學(xué)的研究顯示，腸癌組織抗原修復(fù)時間長于甲狀腺癌組織[25]，與我們的結(jié)論不一致，這可能和組織的前處理、不同的抗原修復(fù)條件及抗體濃度等有關(guān)。但該報道顯示免疫組化法檢測BRAF V600E的特異度低，僅為62.9%，我們推測可能和修復(fù)時間過長導(dǎo)致非特異性著色增加有關(guān)。相關(guān)研究顯示，加熱可以促進抗原暴露抗原決定簇[22,26]。在偏中性及酸性環(huán)境中，暴露的多肽冷卻后更易折疊而隱藏抗原決定簇，在弱堿性環(huán)境中暴露的多肽帶負電荷而阻止抗原決定簇的折疊。因此弱堿性條件有利于BRAF蛋白的修復(fù)。相比于甲狀腺，腸組織有著偏堿性的外周環(huán)境，這可以在一定程度上解釋為什么腸組織相比于甲狀腺需要更少的抗原修復(fù)時間。但是在黏液腺癌中，可能是堿性太強，細胞核的非特異性著色依然存在，KUAN等[16]的研究也顯示，過堿性(pH 9.0)的修復(fù)液也會導(dǎo)致非特異性著色。但是非特異性著色的具體原因仍需要更深入的探討。

免疫組化應(yīng)用于臨床之前需要嚴格而準(zhǔn)確的評分系統(tǒng)。大部分研究都采用強陽性()、中等陽性()、弱陽性(+)及陰性(-)的評分標(biāo)準(zhǔn)[24,27-28]，但是也有研究以陽性腫瘤細胞百分率作為評價的標(biāo)準(zhǔn)[29-30]。我們認為，由于評判結(jié)果難以統(tǒng)一，按照陽性腫瘤細胞百分率作為評價標(biāo)準(zhǔn)的方法并不太適合于臨床病理診斷。本實驗結(jié)果顯示，免疫組化中強陽性的標(biāo)本，PCR陽性，免疫組化陰性的標(biāo)本，PCR也陰性，只有1例弱陽性的標(biāo)本結(jié)果與PCR不符。因此，4個等級的評判標(biāo)準(zhǔn)是更合適的。但是弱陽性標(biāo)本需要進行分子檢測以排除假陽性。

綜上所述，我們認為，在嚴格控制免疫組化染色條件的前提下，VE1抗體檢測BRAF V600E與基因檢測方法具有很高的一致性。對于不具備分子檢測的臨床病理科室來說，免疫組織化學(xué)檢測方法是BRAF V600E檢測的一種有效篩查手段，值得推廣。對于免疫組化弱陽性的標(biāo)本，需要進行基因檢測以排除假陽性。

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