李忠玲,張紅艷,傅 博,岳淑寧*
(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所,陜西 西安 710043;2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心,陜西 西安 710043;3.中國科學(xué)院 西北生物農(nóng)業(yè)中心,陜西 西安 710043)
酪酸菌即丁酸梭菌(Clostridium butyricum),存在于土壤、污泥、人和動(dòng)物腸道以及干酪和自然發(fā)酵的酸奶、酒曲和窖泥中[1]。丁酸梭菌作為一種目前正被逐步廣泛使用的益生菌,已被許多研究證明能促進(jìn)動(dòng)物生長、促進(jìn)乳酸菌等其它有益菌群的增殖、產(chǎn)生B族維生素、維生素K、丁酸等物質(zhì),并能在腸粘膜表面形成微生物屏障,阻止有害菌的定植和入侵,有效地改善腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境,調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)平衡,對(duì)宿主產(chǎn)生各種健康作用[2-3]。丁酸梭菌也能對(duì)一些腸道炎癥有治療效果,HAYASHI A等[4]研究發(fā)現(xiàn),丁酸梭菌誘使腸道巨噬細(xì)胞增殖以抑制結(jié)腸炎。KANAI T等[5]運(yùn)用待測(cè)序技術(shù)等手段表明,丁酸梭菌可作為益生菌誘發(fā)骨髓分化巨噬細(xì)胞在炎癥黏膜上通過Ⅱ型toll樣受體來抑制炎癥。除了能調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌落平衡,提高免疫力外,也有報(bào)道稱酪酸菌對(duì)肝臟損傷有治療和預(yù)防的效果[6],而且還有研究表明酪酸菌對(duì)治療癌癥也有一定功效[7-8]。酪酸菌具有耐高溫、耐高壓、耐胃酸及耐膽鹽等生物學(xué)特性,并在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用效果明顯。作為綠色新型活菌制劑,丁酸梭菌有著十分廣泛的研究前景。同時(shí),有研究表明,酪酸菌還可用于制備丁酸、1,3-丙二醇[9-10]、酶制劑[11]等,隨著相關(guān)研究的深入,酪酸菌必將越來越多的造福人類。目前對(duì)于酪酸菌的進(jìn)一步推廣應(yīng)用,一方面需要更細(xì)化更系統(tǒng)地研究闡明其具體作用機(jī)制,另一方面則是其發(fā)酵工藝的優(yōu)化。酪酸菌的相關(guān)報(bào)道中多以葡萄糖為碳源[12-14],成本較高,本研究以玉米淀粉糖化液為碳源,對(duì)酪酸菌MYS66的發(fā)酵條件進(jìn)行研究,為該菌工業(yè)生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù);并且研究了常用抗生素對(duì)該菌存活率影響,為其進(jìn)一步的應(yīng)用提供技術(shù)支持。
1.1.1 菌種
酪酸菌(Clostridium butyricum)MYS66:初始菌種購自中國科學(xué)院微生物研究所,經(jīng)陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所誘變篩選并編號(hào)保存。
1.1.2 培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基:蛋白胨5.0 g/L,胰蛋白胨5.0 g/L,酵母膏10.0 g/L,葡萄糖10.0 g/L,K2HPO40.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,NaCl 0.5 g/L,pH 7.0。115℃滅菌20 min。
基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉20 g/L(制成糖化液),豆粕粉10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏6 g/L,K2HPO4·3H2O 0.5g/L,KH2PO40.5g/L,NaCl 0.5g/L,pH 7.0。115℃滅菌20 min。
計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:蛋白胨5.0 g/L,胰蛋白胨5.0 g/L,酵母膏10.0 g/L,葡萄糖10.0 g/L,K2HPO4·3H2O 0.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,NaCl 0.5 g/L,pH 7.0。115 ℃滅菌20 min。
1.1.3 試劑
K2HPO4·3H2O、KH2PO4(分析純):廣西汕頭市西隴化工廠;MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NaHCO3、CaCl2、NaCl(均為分析純):西安化學(xué)試劑廠;胰蛋白胨、蛋白胨和酵母膏(均為生化試劑):北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;硫酸粘桿菌素B:河南普華動(dòng)物藥業(yè)有限公司;桿菌肽:美國Sigma公司;莫能霉素鈉、鹽酸林可霉素、新霉素硫酸鹽、磺胺嘧啶:上海源葉生物科技有限公司;酒石酸泰樂菌素:徐州金牌藥業(yè)有限公司;液化酶、糖化酶:寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;玉米粉、豆粕粉均為市售。
DV-650型桌上式(垂直送風(fēng))凈化工作臺(tái):蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司;PYX-DHS-35X40-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;YX280蒸汽滅菌鍋:上海三中醫(yī)療器械有限公司;HH-W21-600-S電熱恒溫水溫箱:上海醫(yī)療器械七廠;PHS-3C型酸度計(jì):上海雷磁儀器廠。
1.3.1 種子活化
取-20℃甘油管保藏的菌種,以1%接種于裝有10 mL種子培養(yǎng)基的厭氧管中,37℃條件下靜態(tài)厭氧活化20 h。
1.3.2 種子培養(yǎng)
將活化的種子液以5%的接種量接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250mL厭氧瓶中。置培養(yǎng)箱中,37℃靜置培養(yǎng)20h。
1.3.3 玉米粉糖化液的制備
玉米粉20 g/L,添加0.5 mg/g原料的CaCl2,在80~85 ℃條件下添加10 U/g原料的液化酶,保溫至液化結(jié)束,液化終點(diǎn)用稀碘液檢測(cè),稀碘液不變藍(lán);將液化液升溫95~100℃保溫10 min進(jìn)行滅酶,之后,降溫至55~60℃,調(diào)pH 4.5,添加300 U/g原料的糖化酶,保溫2 h。
1.3.4 培養(yǎng)方法
將生長好的種子液以5%的接種量接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL厭氧瓶中。置于培養(yǎng)箱中,靜置培養(yǎng)。
1.3.5 菌體濃度測(cè)定
采用平板活菌計(jì)數(shù)法:取培養(yǎng)結(jié)束的發(fā)酵液按10倍稀釋法稀釋成不同濃度稀釋液,分別吸取3種合適的稀釋液各0.1mL置于事先融化并冷卻至50℃左右的牛肉膏、蛋白胨倒好的固體肉湯平板上,用無菌涂布棒涂均勻,每一個(gè)稀釋度涂3個(gè)平皿,涂完后倒置厭氧罐中37℃培養(yǎng)48h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
1.3.6 芽孢計(jì)數(shù)方法
菌液于80℃,10 min熱處理殺滅營養(yǎng)體后,采用上述活菌計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算芽孢濃度,并以芽孢數(shù)與菌體濃度的比記為芽孢率。
1.3.7 發(fā)酵條件優(yōu)化
以菌體濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察不同水平溫度、初始pH、接種量、無機(jī)鹽添加量對(duì)菌體濃度的影響,確定發(fā)酵參數(shù)。
1.3.8 抗生素添加方法
將相應(yīng)抗生素按不同濃度過濾除菌后混入降溫至50℃的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基,同時(shí)以不加抗生素的培養(yǎng)基做空白對(duì)照。
將液體菌種按5%的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃條件下靜置培養(yǎng)32 h,定時(shí)取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),繪制生長曲線,結(jié)果見圖1。由圖1可知,該菌株在8 h達(dá)到生長對(duì)數(shù)期,18 h達(dá)到穩(wěn)定期。
圖1 酪酸菌MYS66的生長曲線Fig.1 Growth curve ofClostridium butyricumMYS66
溫度通過影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能以及細(xì)胞膜的流動(dòng)性及完整性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。過高的溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸的變性失活,過低的溫度會(huì)抑制酶活性,降低細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng)。分別在33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃和40℃條件下培養(yǎng)20h,觀察培養(yǎng)溫度對(duì)酪酸菌MYS66菌體濃度的影響,結(jié)果見圖2。由圖2可知,在溫度低于37℃時(shí)隨著溫度的升高菌體濃度有一定的增長,在37℃達(dá)到最大值,之后隨著溫度的提高菌體濃度呈下降趨勢(shì)。因此,確定酪酸菌MYS66的最適培養(yǎng)溫度為37℃。
圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)酪酸菌MYS66生長的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the growth of Clostridium butyricumMYS66
pH可通過影響蛋白質(zhì)等生物大分子所帶電荷的變化引起細(xì)胞膜電荷變化,導(dǎo)致微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)能力改變,因此培養(yǎng)基的pH對(duì)微生物的生長有重要影響。試驗(yàn)將初始pH設(shè)為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0,37℃條件下靜置培養(yǎng)20 h,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),考察pH對(duì)菌株MYS66生長的影響,結(jié)果見圖3。由圖3可知,菌體濃度隨著初始pH的升高有一定的增長,在初始pH為7.2時(shí)達(dá)到最大,之后隨著初始pH的升高呈下降趨勢(shì),因此,確定酪酸菌MYS66的最適初始pH為7.2。在整體變化趨勢(shì)上,初始pH在7.0~7.6比較平穩(wěn),說明此區(qū)間是該菌的耐受范圍,在此區(qū)間之外菌體濃度下降趨勢(shì)明顯。
圖3 初始pH對(duì)酪酸菌MYS66生長的影響Fig.3 Effect of initial pH on the growth ofClostridium butyricum MYS66
接種量的大小決定生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度,采用較大的接種量可以縮短延滯期,減少雜菌的生長機(jī)會(huì)。但接種量過大會(huì)因前期營養(yǎng)消耗過快而使最終菌體濃度降低,同時(shí),接種量過大會(huì)移入過多代謝廢物,也不經(jīng)濟(jì);相反,接種量過小會(huì)延長培養(yǎng)時(shí)間,降低發(fā)酵的生產(chǎn)效率。試驗(yàn)分別采用2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%的接種量,37℃靜置培養(yǎng)20 h,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),結(jié)果見圖4。由圖4可知,菌體濃度隨著接種量的增大而增加,在接種量為4%時(shí)達(dá)到最大值,之后隨著接種量的增大菌體濃度呈下降趨勢(shì)。因此,確定酪酸菌MYS66的最適接種量為4%。
圖4 接種量對(duì)酪酸菌MYS66生長的影響Fig.4 Effect of inoculum on the growth ofClostridium butyricum MYS66
某些金屬離子可促進(jìn)菌體生長(如K+、Ca2+和Mg2+等);也有報(bào)道稱添加適量CO32-可緩沖酸度變化,并且釋放出的CO2有助于芽孢生成[15]。該試驗(yàn)主要研究了K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NaHCO3、CaCl2和NaCl添加量對(duì)發(fā)酵的影響,各無機(jī)鹽單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。培養(yǎng)條件為初始pH7.2,37℃靜置培養(yǎng)20h,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果見圖5。
表1 無機(jī)鹽優(yōu)化單因素試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of single factor experiments for inorganic salt optimization
由表1和圖5可知,各無機(jī)鹽最佳添加量分別為:KH2PO41.0g/L,K2HPO4·3H2O1.0g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,MnSO4·H2O 0.2 g/L,NaHCO31.0 g/L,CaCl20.2 g/L,NaCl 1.0 g/L。
經(jīng)過以上試驗(yàn),得到了最佳培養(yǎng)條件和各無機(jī)鹽單因素最佳添加量,并以此條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),即將培養(yǎng)基組成優(yōu)化為玉米粉20 g/L(制成糖化液),豆粕粉10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏6 g/L,K2HPO4·3H2O 1.0 g/L,KH2PO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,MnSO4·H2O 0.2 g/L,NaHCO31.0g/L,CaCl20.2g/L,NaCl1.0g/L,在pH7.2,接種量4%,37℃的條件下靜置培養(yǎng)20h,此時(shí)菌體濃度達(dá)到2.66×108CFU/mL。
圖5 無機(jī)鹽對(duì)酪酸菌MYS66生長的影響Fig.5 Effect of inorganic salt on the growth ofClostridium butyricum MYS66
以優(yōu)化的條件進(jìn)行50 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn),即50 L發(fā)酵罐,優(yōu)化后的培養(yǎng)基裝料量35 L,接種量4%,37℃靜置發(fā)酵32 h,測(cè)菌體濃度,芽孢濃度,計(jì)算芽孢率,結(jié)果見圖6。經(jīng)50L發(fā)酵罐發(fā)酵,在發(fā)酵32h,菌體濃度為2.64×108CFU/mL,芽孢濃度達(dá)到2.49×108CFU/mL,芽孢率達(dá)到94.3%。
圖6 酪酸菌MYS66在50 L發(fā)酵罐中的生長情況Fig.6 Growth ofClostridium butyricumMYS66 in 50 L fermenter
大量試驗(yàn)證明,將益生素分別與抗生素、寡糖、酸化劑、中草藥、肽等合理配伍表現(xiàn)出了理想的使用效果[16]。在生產(chǎn)中因動(dòng)物防病和治病的需要可能會(huì)使用某些抗生素類藥物,這些藥物也許會(huì)對(duì)飼用益生菌酪酸菌MYS66的生長產(chǎn)生影響,因此研究常用抗生素對(duì)該菌的影響非常必要,希望對(duì)其在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用有所幫助。主要研究了硫酸粘桿菌素B、桿菌肽、莫能霉素鈉、鹽酸林可霉素、新霉素硫酸鹽、磺胺嘧啶、酒石酸泰樂菌素8種抗生素對(duì)酪酸菌MYS66存活率的影響,結(jié)果見圖7。
圖7 幾種常用抗生素對(duì)酪酸菌MYS66存活率的影響Fig.7 Effects of several common antibiotics on the survival rate of Clostridium butyricumMYS66
由圖7可知,各抗生素對(duì)酪酸菌存活率的影響由低到高的順序?yàn)榱蛩嵴硹U菌素B<莫能霉素鈉<鹽酸林可霉素<酒石酸泰樂菌素<桿菌肽<磺胺嘧啶<新霉素硫酸鹽<鹽酸金霉素。
通過對(duì)酪酸菌發(fā)酵條件的研究,得到了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為玉米粉20 g/L(制成糖化液),豆粕粉10 g/L,蛋白胨10g/L,酵母膏6g/L,K2HPO4·3H2O1.0g/L,KH2PO41.0g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,MnSO4·H2O 0.2 g/L,NaHCO31.0 g/L,CaCl20.2 g/L,NaCl 1.0 g/L;確定最佳發(fā)酵條件為初始pH 7.2,培養(yǎng)溫度37.0℃,接種量4%。經(jīng)50L發(fā)酵罐發(fā)酵32h時(shí),菌體濃度為2.64×108CFU/mL,芽孢濃度為2.49×108CFU/mL,芽孢率達(dá)到94.3%。通過常用抗生素對(duì)該菌存活率影響的研究,結(jié)果表明:各抗生素對(duì)酪酸菌存活率影響由低到高的順序?yàn)榱蛩嵴硹U菌素B<莫能霉素鈉<鹽酸林可霉素<酒石酸泰樂菌素<桿菌肽<磺胺嘧啶<新霉素硫酸鹽<鹽酸金霉素。以上研究結(jié)果為酪酸菌MYS66進(jìn)一步生產(chǎn)及應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
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