反復(fù)凍融次數(shù)和不同保存溫度對(duì)病毒滴度的影響

陳柯君，李 佳，鄧樂(lè)君,3，陳灶妹，趙 月，江 麗,3，張俊輝，李偉達(dá)，李茹冰，李 健1，*

(1.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州 510006；2.廣州總醫(yī)院，廣東廣州 510010；3.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州 510515；4.廣州市電紡生物科技有限公司，廣東廣州 510604)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，可引起豬繁殖障礙，感染高發(fā)期為春夏秋季[1]，主要表現(xiàn)為胚胎和胎兒的感染和死亡，特別是初產(chǎn)母豬發(fā)生死胎、畸形胎和木乃伊胎，但母豬本身無(wú)明顯的癥狀。PPV可以分為PPV-1、PPV-2、PPV-3、PPV-4、PPV-5[2-3]和PPV-6[4]等6種不同遺傳類(lèi)型。PPV最早出現(xiàn)于歐洲，早在1967年Cartwright等通過(guò)對(duì)豬的不孕、流產(chǎn)、死胎等進(jìn)行病原學(xué)研究時(shí)，分離出了豬細(xì)小病毒，首次證明了它的致病作用[5]。我國(guó)首株豬細(xì)小病毒是由潘雪珠等[6]在1983年分離得到的。隨后，張婉華等[7]也把豬死胎的內(nèi)臟經(jīng)過(guò)處理后接種于ST細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，細(xì)胞可產(chǎn)生相應(yīng)的病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞固縮、拉網(wǎng)等變化，結(jié)果證實(shí)該分離毒株為PPV。起初豬是PPV的傳播源，后來(lái)有報(bào)道稱(chēng)，在牛、羊、貓、大鼠和小鼠體內(nèi)都可以檢測(cè)到PPV的特異性抗體，且在感染PPV后可出現(xiàn)流產(chǎn)、死產(chǎn)的現(xiàn)象，這些現(xiàn)象都預(yù)示著PPV的宿主范圍不斷擴(kuò)大[8]。目前豬細(xì)小病毒感染在我國(guó)乃至世界范圍呈遞增趨勢(shì)，該病使畜牧業(yè)的發(fā)展受到了一定的阻礙。

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科A型皰疹病毒亞科豬皰疹病毒1型，主要通過(guò)呼吸道傳染，宿主范圍廣，可導(dǎo)致多種家畜及野生動(dòng)物被感染，其中患病豬是偽狂犬病病毒的主要儲(chǔ)存宿主和傳染源?；疾∽胸i群主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、腹瀉，病死率可高達(dá)100%，保育及育肥豬群主要表現(xiàn)為呼吸障礙綜合征，種豬群則主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、弱胎、繁殖障礙等癥狀[9]。感染的成年豬以潛伏感染和隱性感染居多，無(wú)典型的臨床癥狀出現(xiàn)，但感染豬一直攜帶病毒并自身可進(jìn)行周期性排毒，為該病的根除增加了一定的難度[10-11]。2011年在河南省及其臨近省市暴發(fā)了極其嚴(yán)重的偽狂犬病疫情，隨后疫情迅速向南方蔓延，覆蓋了大半個(gè)中國(guó)，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。

在一些血液制品的生產(chǎn)中，需要用豬細(xì)小病毒和偽狂犬病病毒來(lái)驗(yàn)證生產(chǎn)工藝中所使用的滅活方法滅活病毒的效果，由于病毒是用于工藝驗(yàn)證的，所以病毒的滴度和保存至關(guān)重要，這將影響到病毒的質(zhì)量，從而影響病毒滅活效果的判斷。

PPV為單股負(fù)鏈DNA、無(wú)包膜病毒；PRV為雙鏈DNA、有囊膜病毒。由于PPV在侵染宿主細(xì)胞時(shí)屬于隱性感染，PPV相對(duì)于其他病毒來(lái)說(shuō)屬于致細(xì)胞病變能力較弱的一類(lèi)病毒，病毒的滴度難以提高，想要宿主細(xì)胞出現(xiàn)病變則需要將PPV盲傳數(shù)代才能實(shí)現(xiàn)[13]，這主要是由于PPV獨(dú)特的分子生物學(xué)特性造成的。有文獻(xiàn)報(bào)道[5]，可以通過(guò)與胰酶短時(shí)間(1 h內(nèi))接觸來(lái)可提高PPV的感染力，所以在進(jìn)行PPV培養(yǎng)時(shí)，可以用該方法來(lái)提高PPV的滴度，但是關(guān)于該方法的具體操作卻沒(méi)有文獻(xiàn)具體說(shuō)明。雖然在一些文獻(xiàn)中提到可以采用反復(fù)凍融的方法來(lái)提高病毒滴度，但是具體提高了多少滴度卻不得而知。筆者以此為切入點(diǎn)，探討不同的反復(fù)凍融次數(shù)對(duì)病毒滴度的影響。在病毒的保存過(guò)程中，溫度對(duì)病毒滴度的影響起到關(guān)鍵作用，因此，本研究探討病毒的保存溫度對(duì)病毒滴度的影響，希望能為病毒的研究過(guò)程提供一些參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)、豬細(xì)小病毒，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)、偽狂犬病病毒，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院輸血科提供。

1.1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品 ，置2℃～8℃保存;PBS，Hyclone公司產(chǎn)品 ，置15℃～30℃保存;胎牛血清、胰酶，Gibco公司產(chǎn)品，置-20℃保存;細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液：在500 mL DMEM培養(yǎng)液中加入50 mL胎牛血清，10 000單位/mL的青霉素，10 000單位/mL的鏈霉素，配成含100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆?細(xì)胞生長(zhǎng)維持液：在500 mL DMEM培養(yǎng)液中加入10 mL胎牛血清，配成含20 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 病毒的收集 細(xì)胞培養(yǎng)采用T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用含100 mL/L胎牛血清的細(xì)胞生長(zhǎng)用培養(yǎng)液。病毒培養(yǎng)采用含20 mL/L胎牛血清的細(xì)胞生長(zhǎng)維持培養(yǎng)液。文中除特別說(shuō)明外，病毒接種均按照如下方法進(jìn)行：先倒掉培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長(zhǎng)用培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，每瓶接種1 mL病毒液，37℃吸附培養(yǎng)2 h，棄病毒上清液，加入與初始生長(zhǎng)培養(yǎng)液等體積的細(xì)胞生長(zhǎng)維持液繼續(xù)培養(yǎng)。待80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收獲病毒懸液，即為病毒原液。

1.2.2 反復(fù)凍融次數(shù)試驗(yàn) 將收集的含ST細(xì)胞的豬細(xì)小病毒和含Vero細(xì)胞的偽狂犬病病毒經(jīng)過(guò)不同的反復(fù)凍融次數(shù)，凍融次數(shù)分別為0、1、3、5、7次，測(cè)定上清液中的病毒滴度。

1.2.3 保存期試驗(yàn) 將病毒原液分別于4、22、-20、-80℃保存，分別在1 d、1周、2周、4周后測(cè)定其病毒滴度。

1.2.4 病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量(TCID50)測(cè)定 將待測(cè)病毒用細(xì)胞生長(zhǎng)維持液按10倍系列梯度稀釋?zhuān)?0-1、10-2～10-9等。將100 μL不同稀釋度的病毒液加入長(zhǎng)滿單層宿主細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度4孔，然后置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察，逐孔記錄細(xì)胞病變情況。

病毒滴度以半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量(TCID50)表示，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50，TCID50的對(duì)數(shù)值計(jì)算公式如下：

TCID50對(duì)數(shù)值=病變率高于50%組稀釋度的對(duì)數(shù)值+距離比例

距離比例=(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù))

2 結(jié)果

2.1 病毒反復(fù)凍融次數(shù)的試驗(yàn)結(jié)果

含ST細(xì)胞的豬細(xì)小病毒在凍融3次時(shí)病毒滴度最高，比凍融0次的病毒滴度提高了大約1.81 lg。凍融1次比凍融0次的病毒滴度提高了約0.47 lg。凍融5次比凍融0次的病毒滴度提高了約0.61 lg。凍融7次比凍融0次的病毒滴度降低了約0.19 lg。凍融0次和7次、凍融1次和5次、PPV的病毒滴度不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。凍融0次和1次、凍融1次和7次、凍融5次和7次，PPV的病毒滴度存在顯著性差異(P<0.05)。凍融0次和3次、凍融0次和5次、凍融1次和3次、凍融3次和5次、凍融3次和7次，PPV的病毒滴度的差異極顯著(P<0.01)(表1)。

含Vero細(xì)胞的偽狂犬病病毒在凍融3次時(shí)病毒滴度最高，比凍融0次的病毒滴度提高了大約1.86 lg。凍融1次比凍融0次的病毒滴度提高了約0.39 lg。凍融5次比凍融0次的病毒滴度提高了約0.71 lg。凍融7次比凍融0次的病毒滴度降低了約0.30 lg。凍融0次和1次、凍融1次和5次、PRV的病毒滴度差異不顯著(P>0.05)。凍融0次和5次、凍融0次和7次、凍融1次和7次、凍融3次和5次，PRV的病毒滴度差異顯著(P<0.05)。凍融0次和3次、凍融1次和3次、凍融3次和7次、凍融5次和7次，PRV的病毒滴度的差異極顯著(P<0.01)(表1,圖1和圖2)。

表1 含宿主細(xì)胞的病毒反復(fù)凍融對(duì)病毒滴度的影響

圖1 含ST細(xì)胞的PPV反復(fù)凍融對(duì)病毒滴度的影響

圖2 含Vero細(xì)胞的PRV反復(fù)凍融對(duì)病毒滴度的影響

2.2 豬細(xì)小病毒液的保存期試驗(yàn)結(jié)果

不同保存溫度和時(shí)間PPV病毒滴度的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)病毒滴度與初始結(jié)果比較，在-80℃保存條件下，經(jīng)過(guò)了1 d豬細(xì)小病毒與初始病毒滴度(6.29 lg)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在1周～4周，豬細(xì)小病毒與初始病毒滴度(6.29 lg)相比，具有極顯著差異(P<0.01)。在-20℃保存條件下儲(chǔ)存1 d～4周，豬細(xì)小病毒與初始病毒滴度(6.29 lg)相比，具有極顯著差異(P<0.01)。在4℃保存條件下儲(chǔ)存1 d～4周，豬細(xì)小病毒與初始病毒滴度(6.29 lg)相比，具有極顯著差異(P<0.01)。在22℃保存條件下儲(chǔ)存1 d～4周之后，豬細(xì)小病毒與初始病毒滴度(6.29 lg)相比，具有極顯著差異(P<0.01)(圖3)。

表2 豬細(xì)小病毒液的保存期試驗(yàn)

注：*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：*Means significant difference(P<0.05);**Means extremely significant difference(P<0.01).

圖3 豬細(xì)小病毒的病毒滴度隨溫度變化

2.3 偽狂犬病病毒液的保存期試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)不同的保存溫度和時(shí)間，PRV滴度的TCID50檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)病毒滴度與初始結(jié)果比較，在-20℃和-80℃保存條件下，經(jīng)過(guò)了1 d～1周偽狂犬病病毒滴度與初始病毒滴度(8.00 lg)相比，差異不顯著(P>0.05)；在2周～4周之后，偽狂犬病病毒滴度與初始病毒滴度(8.00 lg)相比，差異極顯著(P<0.01)。在4℃保存條件下，經(jīng)過(guò)了1 d～4周偽狂犬病病毒滴度與初始病毒滴度(8.00 lg)相比，差異極顯著(P<0.01)。在22℃保存條件下，在1周～4周偽狂犬病病毒與初始病毒滴度(8.00 lg)相比，差異極顯著(P<0.01)(圖4)。

表3 偽狂犬病病毒液的保存期試驗(yàn)

注：**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：**Means extremely significant difference(P<0.01).

圖4 偽狂犬病病毒的病毒滴度隨溫度變化

3 討論

在病毒的收集過(guò)程中，病毒的凍融次數(shù)是影響病毒滴度的關(guān)鍵因素。一般情況下凍融3次可以提高病毒的滴度約1.80 lg，這可能與凍融可以使吸附在宿主細(xì)胞體內(nèi)的病毒釋放有關(guān)。但不是凍融次數(shù)越多病毒滴度越高，在凍融5次時(shí)即出現(xiàn)病毒滴度下降的趨勢(shì)，凍融7次甚至出現(xiàn)了比凍融0次的滴度還低的情況，這可能是由于宿主細(xì)胞中的病毒已經(jīng)完全釋放，而之后的凍融操作會(huì)降低上清液中的病毒滴度所造成的。

廖煥蘭等[14]與本試驗(yàn)的探討對(duì)象不同，他們旨在探討反復(fù)凍融次數(shù)對(duì)不含宿主細(xì)胞的人乳頭瘤病毒DNA載量的影響，其結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)凍融1、5、10次的人乳頭瘤病毒的DNA載量與原初始結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而本試驗(yàn)的探討對(duì)象是含宿主細(xì)胞的病毒，且本試驗(yàn)的結(jié)果顯示，含宿主細(xì)胞的病毒經(jīng)過(guò)3次凍融可以使病毒滴度提高至少1.8 lg。對(duì)于豬細(xì)小病毒而言，凍融1、3、5次均與凍融0次的病毒滴度有顯著性差異，而凍融7次與凍融0次的病毒滴度沒(méi)有顯著性差異。對(duì)于偽狂犬病病毒而言，凍融3、5、7次均與凍融0次的病毒滴度有顯著性差異，而凍融1次與凍融0次的病毒滴度沒(méi)有顯著性差異。造成這樣的原因可能與豬細(xì)小病毒是隱性感染特質(zhì)有關(guān)。

在實(shí)際生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、使用過(guò)程中影響病毒滴度的因素之中，溫度是一個(gè)非常重要的因素。不同保存溫度會(huì)對(duì)病毒滴度造成一定的影響。一般情況下，溫度越低，病毒滴度的變化越小，故病毒在較低的溫度下可保存更長(zhǎng)的時(shí)間。

張苗苗等[15]的保存期試驗(yàn)結(jié)果表明，偽狂犬病病毒液在2℃～8℃至少可存放3個(gè)月，但在-20℃以下存放病毒滴度下降較快。這與本試驗(yàn)中所得出的結(jié)果不同，筆者在4℃保存條件下，放置了1 d～4周的偽狂犬病病毒滴度與初始病毒滴度相比，差異極顯著(P<0.01)，而在-20℃放置1 d～1周偽狂犬病病毒滴度與初始病毒滴度相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病毒滴度的變化不大。鄔君等[16]還研究了在病毒液中加入甘油和MgCl2的情況,他們認(rèn)為甘油和MgCl2對(duì)病毒載體的活性影響不大。筆者認(rèn)為甘油可作為微生物凍存的保護(hù)劑，它的加入是允許的，在病毒的培養(yǎng)過(guò)程中也不需要去除。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒對(duì)溫度都比較敏感。豬細(xì)小病毒在-80℃溫度下儲(chǔ)存病毒滴度雖然稍有下降，但是與初始病毒滴度相比變化不大。豬細(xì)小病毒在-20℃溫度下儲(chǔ)存病毒滴度雖然有所下降，但是病毒滴度下降的速度比在4℃和22℃下降的慢，所以4℃和22℃只能作為豬細(xì)小病毒的短期儲(chǔ)存溫度(圖1)。偽狂犬病病毒在-20℃和-80℃溫度下儲(chǔ)存1周內(nèi)病毒滴度沒(méi)有明顯的變化，從第2周開(kāi)始病毒滴度有所下降，但是病毒滴度變化不大；但是在-80℃溫度保存的病毒滴度下降的速度比在-20℃溫度的慢些(圖2)。在22℃溫度下儲(chǔ)存4周，就已經(jīng)完全喪失毒力、失去感染力，即使是病毒毒力很強(qiáng)、侵染能力很強(qiáng)的偽狂犬病病毒(8.00 lg)也不例外。總的來(lái)說(shuō)，-20℃和-80℃對(duì)病毒的保存來(lái)說(shuō)是一個(gè)相對(duì)比較好的保存溫度，溫度越低，對(duì)病毒的保存越有利。但是如果要保存更長(zhǎng)時(shí)間，如幾年甚至十幾年，則需要用真空冷凍干燥法將病毒制成凍干粉劑,一般會(huì)在病毒凍干時(shí)加入50 g/L蔗糖。在某種意義上，病毒的保存與細(xì)胞的保存方法相似。但是與病毒保存方式不同的是，細(xì)胞一般是在液氮中可儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，而且細(xì)胞凍存液中需要加入甘油或者DMSO作為保護(hù)劑。

綜上所述，在培養(yǎng)病毒時(shí)，研究者可用反復(fù)凍融3次的方法將病毒的滴度提高至少1.80 lg以上，避免將棄去宿主細(xì)胞之后收集的病毒進(jìn)行反復(fù)凍融，以免降低病毒滴度。

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