中藥抗牛病毒性腹瀉病毒作用研究現(xiàn)狀

王 慧 ，杜 銳，周紅潮，時(shí) 坤，李建明，曾范利，宗 穎*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；2.教育部動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130118；3.吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，吉林長春 130118)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員，為具有包膜的單股正鏈RNA病毒[1]。1980年，李佑民在國內(nèi)首次分離鑒定該病毒[2]。隨后，根據(jù)BVDV基因組的差異，將BVDV分為1型和2型，根據(jù)BVDV在靶細(xì)胞中是否引起細(xì)胞病變，BVDV又可分為致細(xì)胞病變型(cytopathic biotype，CP)和非細(xì)胞致變型(non-cytopathic biotype，NCP)[3]。該病毒能夠引起多種疾病的發(fā)生，如BVDV感染牛群發(fā)生牛病毒性腹瀉-黏膜病及免疫持續(xù)性感染嚴(yán)重疾病，發(fā)病率和病死率很高[4]，該病毒引起的疾病已經(jīng)由世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的傳染病。目前統(tǒng)計(jì)出牛群每年僅死于牛病毒性腹瀉黏膜病的數(shù)量不少于500萬頭[2]。對(duì)于BVDV在牛群中出現(xiàn)的流行性感染，世界各地采取的處置方法多是接種疫苗、淘汰凈化和做好相應(yīng)的安全管理[5]。然而，疫苗的使用具有一定的局限性，至今也尚未研制出有效的疫苗來預(yù)防BVD[6]，導(dǎo)致BVD預(yù)防形勢(shì)極不樂觀。此外，該病毒宿主群正在不斷擴(kuò)大，廣泛涉及到鹿、豬、羊及其他野生動(dòng)物[7]。近年來，BVDV感染人群亦有相關(guān)報(bào)道。這種情形不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]，也對(duì)人類是一種潛在的威脅。因此，尋找和開發(fā)新的安全、高效、低毒的BVDV殺滅抑制劑已勢(shì)在必行。中藥作為我國優(yōu)勢(shì)特色資源，因其活性強(qiáng)且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，已日益成為治療病毒性疾病藥物研究開發(fā)的熱點(diǎn)[9-11]?，F(xiàn)就中藥及其復(fù)方在抗BVDV中的研究做以歸納和總結(jié)，以期為抗BVDV的藥物研究開發(fā)提供參考。

1 BVDV侵染細(xì)胞過程

BVDV感染需要依賴網(wǎng)絡(luò)蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑[12]，其生存需要依賴于宿主細(xì)胞。如BVDV可在胎牛腎臟細(xì)胞(MDBK)、睪丸細(xì)胞等多種細(xì)胞中進(jìn)行生存培養(yǎng)。BVDV與細(xì)胞表面的特殊受體相結(jié)合為起始，經(jīng)過多級(jí)過程入侵和黏附細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后病毒完成生命周期的復(fù)制和翻譯[13]。然而，BVDV致病的關(guān)鍵是病毒蛋白與宿主蛋白之間的相互作用，它們之間的相互作用不僅可以使病毒進(jìn)入細(xì)胞，而且可以改變宿主蛋白的正常生物學(xué)功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和持續(xù)性感染[14]。從感染動(dòng)物的角度看，BVDV最初進(jìn)入上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，在這些細(xì)胞中，BVDV將完成復(fù)制和擴(kuò)散在整個(gè)淋巴系統(tǒng)，從而感染動(dòng)物的免疫系統(tǒng)[15]。

2 中藥抗病毒作用機(jī)理

隨著中藥的廣泛使用，中藥的科學(xué)價(jià)值越來越得到國際的認(rèn)可[16]，尤其在抗生素濫用導(dǎo)致很多人畜共患病出現(xiàn)的情況下，其在抗病毒方面的顯著作用引起了國內(nèi)外學(xué)者們的高度重視?，F(xiàn)有關(guān)于中藥抗病毒的機(jī)理和途徑相關(guān)研究結(jié)果表明，中藥抗病毒作用途徑主要分為直接途徑和間接途徑兩種。直接抗病毒作用是指病毒侵入前藥物主要通過抑制病毒DNA、RNA的合成、阻止病毒的吸附及穿入[17]，直接滅活病毒來抑制病毒的增殖，同時(shí)藥物也可阻止病毒由感染細(xì)胞侵染未感染細(xì)胞等多種途徑來抗病毒。間接途徑抗病毒則主要表現(xiàn)為促進(jìn)免疫器官發(fā)育、增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫、誘生干擾素以及多種細(xì)胞因子的綜合調(diào)節(jié)及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多種方式。而有些中藥則通過直接和間接兩種方式相結(jié)合更有效地達(dá)到抗病毒的效果[18-20]。所以，可根據(jù)中藥不同的抗病毒作用機(jī)理，開發(fā)出相應(yīng)的病毒進(jìn)入抑制劑、病毒復(fù)制抑制劑、包裝和組裝抑制劑和免疫調(diào)節(jié)劑等抗病毒藥物[21]。

3 中藥抗BVDV的研究方法

測(cè)定抗BVDV活性常用的方法是利用BVDV在細(xì)胞培養(yǎng)體系中的感染和復(fù)制能力進(jìn)行體外細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)，主要使用的細(xì)胞為MDBK細(xì)胞。中藥抗BVDV目前研究?jī)?nèi)容主要包括：①病毒毒力的測(cè)定。采用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，觀察接毒后的細(xì)胞形態(tài)，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)判斷病毒導(dǎo)致細(xì)胞病變程度，運(yùn)用Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞感染量，并計(jì)算出TCID50值來評(píng)定病毒毒力的大小。②采用細(xì)胞病變效應(yīng)、染料吸收法，確定最大給藥量。在安全給藥劑量范圍內(nèi)，不同的加入方式(藥物和病毒同時(shí)；先給藥物，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后再加入病毒；先加入病毒，間隔2 h后再加入藥物；先藥物與病毒同加，然后再加藥)來研究藥物對(duì)病毒的直接滅活作用；藥物對(duì)病毒的阻斷作用；藥物對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用；藥物對(duì)病毒的綜合抑制作用。目前，使用評(píng)價(jià)藥物抗BVDV活性效果的指標(biāo)是通過細(xì)胞病變效應(yīng)和染料吸收法。其細(xì)胞病變法主要是細(xì)胞接種藥物和病毒后，以細(xì)胞病變程度為指標(biāo)來衡量藥物對(duì)病毒的作用，進(jìn)而評(píng)價(jià)藥物的抗病毒效果。染料吸收法包括MTT染色法和中性紅染色法，兩種方法均通過酶標(biāo)儀測(cè)OD值，反映接種藥物和病毒后的細(xì)胞在一定時(shí)間活細(xì)胞的數(shù)量的改變，通過抑制率確定藥物抗病毒的效果及其藥物抗病毒的作用方式。

4 中藥抗BVDV的研究進(jìn)展

自1946年起，西藥已開始用于對(duì)BVDV感染引起的BVD疾病進(jìn)行研究[22]。有關(guān)研究提出了利巴韋林能與干擾素(INF-α)聯(lián)合應(yīng)用能有效控制BVDV感染，但約40%會(huì)出現(xiàn)病毒學(xué)反應(yīng)[23]。感染早期，BVDV對(duì)氯喹、氯丙嗪和金雀異黃酮、氯化銨等藥物都比較敏感[24]。但至今，BVDV的感染仍不能通過西藥得到理想的控制。而有些中藥具有強(qiáng)效抗BVDV作用已被證實(shí)。

4.1 抗BVDV的中藥成分

不同種類的中藥抗BVDV的作用強(qiáng)弱具有顯著性差異。金絲桃素為貫葉連翹的有效成分之一，為抗病毒的中藥活性單體[25]，屬于萘駢二蒽酮類化合物。郭志廷等[26]將金絲桃素制備成可溶性粉，在0.3 g/L～2.5 g/L范圍內(nèi)確定出金絲桃素對(duì)BVDV具有直接殺滅作用。選用西藏莖直黃芪來提取生物堿類成分苦馬豆素(SW)，體外抗BVDV活性試驗(yàn)結(jié)果表明，苦馬豆素對(duì)BVDV的綜合抑制作用最佳，直接作用和抑制作用較好，而阻斷作用不理想[27]。郝寶成[28]還進(jìn)一步推測(cè)了苦馬豆素發(fā)揮抗BVDV活性作用的途徑可能是通過進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部對(duì)BVDV的復(fù)制產(chǎn)生抑制及直接滅活游離BVDV。沙冬青總黃酮部位具有顯著的體外抗BVDV活性,藥物濃度為0.188 mg/mL時(shí)，其對(duì)病毒直接殺滅作用非常顯著，病毒抑制率高達(dá)89.44%[29-30]；沙冬青總生物堿(主要包括左旋黃花木堿、鷹爪豆堿、黃花堿、異黃花堿等)對(duì)抗BVDV活性研究證實(shí)，當(dāng)藥物濃度為0.32 g/L時(shí)，其抑制病毒復(fù)制的效果顯著，抑制率達(dá)79.80%；沙冬青總生物堿濃度低于0.39 g/L時(shí)，可作為細(xì)胞保護(hù)劑促進(jìn)細(xì)胞增殖[31-32]。此外，研究表明人參皂苷在濃度為1.60 μg/mL～ 80 μg/mL，五味子乙素濃度為0.44 μg/mL～19.35 μg/mL，鹿角盤多糖濃度為2 μg/mL～39 μg/mL時(shí)，不同成分、不同濃度的3種藥物均對(duì)抗BVDV有顯著的作用，且在安全劑量范圍內(nèi)，藥物抗BVDV的作用強(qiáng)度與藥物濃度的增加呈正相關(guān)[33-35]。

4.2 抗BVDV的中藥復(fù)方

目前，國內(nèi)外對(duì)于抗BVDV的復(fù)方中藥研究較少。楊帆等[36]采用水提和醇提兩種方法從具有抗病毒藥物黃芩、黃柏、梔子等14味組方方劑中提取4種提取物，選用犢牛睪丸細(xì)胞進(jìn)行體外抗BVDV活性研究。結(jié)果表明，4種提取物均對(duì)BVDV具有抑制作用，但其活性的強(qiáng)弱具有根據(jù)給藥方式的不同，抗BVDV的作用藥效強(qiáng)弱也不同。Wang J Y等[37]研究表明，黃芩梔子復(fù)方(黃芩、秦皮、梔子、大黃、牡丹皮、生地黃、訶子、石榴皮、厚樸、枳殼)治療BVDV引起的牛腹瀉疾病有效率高達(dá)95%，治愈率達(dá)75%。其中已證實(shí)黃芩、梔子在體外抑制BVDV在10味藥物中占主導(dǎo)作用。此外，鄭春麗[22]對(duì)黃芩梔子復(fù)方體外抗BVDV活性機(jī)制進(jìn)行了探討，結(jié)果表明，黃芩梔子復(fù)方可直接抑制BVDV的復(fù)制，并通過調(diào)節(jié)免疫功能發(fā)揮抗BVDV作用,同時(shí)推測(cè)中藥也可能是通過調(diào)節(jié)干擾素來抗BVDV活性起到治療BVD的作用。郜玉剛[38]選用黃芪注射液、魚腥草注射液、莪術(shù)油注射液、雙黃連粉針劑4種中藥復(fù)方制劑對(duì)抗BVDV的有效性進(jìn)行研究，通過對(duì)4種中藥抗BVDV作用的強(qiáng)弱進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn)，在不同的加入方式下其抗病毒的強(qiáng)弱不同,當(dāng)采用藥毒同加時(shí)，抗BVDV活性由強(qiáng)到弱依次是莪術(shù)油、魚腥草、黃芪、雙黃連，先加藥后接毒時(shí)魚腥草、莪術(shù)油、黃芪、雙黃連效果依次減弱，先加病毒后加藥物抗BVDV作用強(qiáng)弱順序?yàn)檩g(shù)油、魚腥草、黃芪、雙黃連。

5 小結(jié)

BVDV引起的病毒性疾病危害巨大，當(dāng)缺乏疫苗和治療標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)有效且具有成本效益的藥物對(duì)于控制病毒十分迫切?，F(xiàn)有研究表明中藥體外抗BVDV活性顯著，具有較好開發(fā)潛質(zhì)。但目前國內(nèi)外對(duì)于抗BVDV的中藥及復(fù)方研究較少，尚存在很多科學(xué)問題需要研究，如中藥及復(fù)方對(duì)于不同生物型的BVDV作用是否存在差異，在動(dòng)物體內(nèi)是否亦會(huì)發(fā)揮顯著抗BVDV作用，其抗BVDV的作用靶點(diǎn)如何確定等。充分利用快速發(fā)展的現(xiàn)代生物技術(shù)，建立合理科學(xué)的試驗(yàn)方法與監(jiān)測(cè)指標(biāo)，針對(duì)病毒感染的不同環(huán)節(jié)進(jìn)行深入研究，并使體內(nèi)與體外評(píng)價(jià)、基礎(chǔ)與臨床研究密切配合，開發(fā)出具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的符合國際標(biāo)準(zhǔn)的抗BVDV藥物。

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