自動(dòng)QuEChERS方法結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)玉米中133種農(nóng)藥的多殘留分析

王濟(jì)世,賀澤英,徐亞平,王 璐,彭 祎,劉瀟威

（農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191）

玉米是重要的糧食作物和重要的飼料來源。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為了減少病蟲草害[1-2]，保證玉米產(chǎn)量，不可避免地需要使用農(nóng)藥[3]。然而，當(dāng)食用農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量超過一定水平，就可能會(huì)對(duì)人類的健康造成危害[4-5]。為了保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和食用者身體健康，我國明確規(guī)定了食品中的農(nóng)藥最高殘留限量（MRLs）?？焖贆z測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留是保證食品安全的重要手段，而快速、簡(jiǎn)便、靈敏的分析方法，將成為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的主要目標(biāo)[6]。

Anastassiades等[7-8]在2003年首次提出了QuECh-ERS（快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效、耐用、安全）方法，并對(duì)其在農(nóng)藥多殘留檢測(cè)中的簡(jiǎn)便性和廣泛適用性進(jìn)行了驗(yàn)證，現(xiàn)已得到廣泛認(rèn)可。該方法主要分為兩個(gè)步驟：提取和凈化。在基質(zhì)前處理過程中常用乙腈作為提取溶劑，并加入專用萃取鹽包去除基質(zhì)中的水分等干擾物，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至凈化材料中，利用分散固相萃取技術(shù)進(jìn)行凈化[9]。為了使QuEChERS方法適用范圍更廣，研究人員不斷對(duì)提取溶劑，凈化材料等步驟進(jìn)行改進(jìn)和完善[10-13]。

目前，國外也研究開發(fā)了一些自動(dòng)化比較強(qiáng)的QuEChERS方法，但價(jià)格昂貴。而我國本立科技公司新研發(fā)的自動(dòng)QuEChERS前處理設(shè)備價(jià)格低，簡(jiǎn)單快捷，具有很好的應(yīng)用前景。本研究在QuEChERS方法的基礎(chǔ)上，借助自動(dòng)QuEChERS前處理設(shè)備，建立了一個(gè)更加簡(jiǎn)單、便捷的方法——高通量自動(dòng)QuECh-ERS方法。為保證方法的適用性，在自動(dòng)QuEChERS方法建立過程中，選擇了基質(zhì)較復(fù)雜的谷物——玉米進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)合LC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)該方法的實(shí)用性進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher）；乙酸（優(yōu)級(jí)純，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水；EN法（歐盟標(biāo)準(zhǔn)）萃取鹽包（美國Agilent公司）：內(nèi)含4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉；AOAC法（美國標(biāo)準(zhǔn)）萃取鹽包（美國Agilent公司）：內(nèi)含6 g無水硫酸鎂，1.5 g醋酸鈉；陶瓷均質(zhì)子（美國Agilent公司）；凈化材料：無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺（PSA）及C18150 mg（美國Agilent公司）；鋯珠（R101、R104）和雙層提取凈化管（本立科技公司）；針管式過濾膜（0.22 μm，美國 Agilent公司）。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（美國Chem Service公司和德國Dr.Ehrenstorfer公司），純度大于98%。將133種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液用丙酮作溶劑配成5 mg·L-1混標(biāo)溶液，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

玉米面粉購自天津市的超市。

1.2 儀器

渦旋振蕩器（Thermo，美國）；高速冷凍離心機(jī)（Heal Force，香港）；Qtrap 4500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀和Acquity LC100高效液相色譜儀（美國AB Sciex公司）；C18色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）購于美國Waters公司。

1.3 自動(dòng)前處理設(shè)備

自動(dòng)QuEChERS前處理設(shè)備是一款自動(dòng)程序控制分析樣品制備的設(shè)備，利用強(qiáng)力立體“8”字振蕩造成渦旋效果，實(shí)現(xiàn)提取效能；再與電機(jī)單向運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)的離心功能相結(jié)合，來完成樣品中待測(cè)成分的提取和凈化。與配套提取管組合，開發(fā)出全新的自動(dòng)QuEChERS處理方法，其流程示意圖見圖1。

自動(dòng)QuEChERS前處理設(shè)備專用提取管由內(nèi)外兩層管組成，內(nèi)管側(cè)壁開若干小孔，孔上覆有只允許提取溶劑通過的半透性微孔膜。使用時(shí)，先將樣品加入外管，再加入提取劑，并放入鋯珠，將裝有凈化材料的內(nèi)管插入外管內(nèi)，擰緊放入提取儀中。儀器自動(dòng)順序?qū)崿F(xiàn)兩次振蕩和離心。振蕩時(shí)，在鋯珠的幫助下，樣品與提取劑充分接觸混合。當(dāng)振蕩提取結(jié)束，開始離心時(shí)，樣品受到離心力的作用，提取液與提取殘?jiān)蛛x，提取液透過微孔濾膜進(jìn)入到內(nèi)管，迅速得到潔凈的上清液，再經(jīng)過二次振蕩與凈化劑充分作用得到凈化。圖2為提取管的抑制滲透效果及對(duì)實(shí)際樣品的處理效果。

1.4 檢測(cè)條件

1.4.1 液相條件

柱溫40℃，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.2%醋酸銨，進(jìn)樣量 5 μL，流速 0.3 mL·min-1。梯度洗脫程序見表1。

上式中，和分別表示非耐用品與耐用品的價(jià)格；Ht表示消費(fèi)者新購買的耐用品；Bt表示無風(fēng)險(xiǎn)債券；與分別表示非耐用品部門與耐用品部門名義工資；與表示消費(fèi)者在非耐用品部門與耐用品部門的就業(yè)；Rt表示名義利率；為物質(zhì)資本租金率；常量K表示物質(zhì)資本，與Barsky et al. 相同，[17]我們將物質(zhì)資本設(shè)定為常數(shù)，原因在于任意時(shí)期經(jīng)濟(jì)中可供使用的物質(zhì)資本數(shù)量是一定的(取決于上一時(shí)期末物質(zhì)資本存量)；Ot表示消費(fèi)者獲得的其他收入。定義δ為耐用品的折舊率，耐用品Dt的動(dòng)態(tài)積累過程為：

1.4.2 質(zhì)譜條件

氣簾氣（CUR）25 psi（1 psi=6.895 kPa），碰撞活化參數(shù)（CAD）中等，離子噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度500℃，離子源氣體1（GS1）50 psi；離子源氣體2（GS2）50 psi。目標(biāo)化合物的保留時(shí)間、離子對(duì)、去簇電壓、碰撞能質(zhì)譜條件見表2。

1.5 樣品的制備

EN法：（1）稱取玉米樣品5 g于離心管外管中，加入混標(biāo)溶液（外標(biāo)法），靜置30 min；（2）加入10 mL水渦旋混勻，靜置 30 min；（3）加入10 mL乙腈，加入EN萃取鹽包及10顆鋯珠，擰緊內(nèi)管（內(nèi)含無水硫酸鎂 450 mg，PSA 75 mg，C1875 mg）；（4）放入自動(dòng)QuEChERS前處理設(shè)備開始處理。處理結(jié)束后從內(nèi)管中取清液1 mL過0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

圖1 自動(dòng)QuEChERS方法流程示意圖Figure 1 Diagram of automated QuEChERS method

圖2 提取管的抑制滲透效果圖Figure 2 Diagram of double centrifuge tubes prevent the osmosis

表1 流動(dòng)相梯度洗脫參數(shù)Table 1 The gradient elution procedure of mobile phase

AOAC法：與EN法不同的是（3）加入10 mL乙腈（含1%乙酸），加入AOAC萃取鹽包及10顆鋯珠，擰緊內(nèi)管（內(nèi)含無水硫酸鎂600 mg、PSA 200 mg、C18200 mg）；其他步驟相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取時(shí)間的優(yōu)化

為了探索最優(yōu)的提取時(shí)間，對(duì)均質(zhì)分離工作站第一階段的振蕩時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化比較。本實(shí)驗(yàn)將第一階段振蕩時(shí)間分別設(shè)置1、2、3 min進(jìn)行對(duì)比，轉(zhuǎn)速1000 r·min-1，保持后面三個(gè)階段處理時(shí)間不變：第二階段離心 5 min，轉(zhuǎn)速 4000 r·min-1；第三階段振蕩 3 min，轉(zhuǎn)速1000 r·min-1；第四階段離心3 min，轉(zhuǎn)速4000 r·min-1。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)?shù)谝浑A段的振蕩時(shí)間為2 min和3min時(shí)，回收率相近?；谛首顑?yōu)化，第一階段的振蕩時(shí)間定為2 min。實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)第二至第四階段離心振蕩時(shí)間也進(jìn)行了優(yōu)化，但對(duì)結(jié)果影響不大。

2.2 提取方法的比較

實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種提取方法（EN和AOAC）進(jìn)行了比較。從兩種方法得到的色譜圖（圖4）可以發(fā)現(xiàn)，兩種方法提取效果差異不大。但AOAC方法提取溶劑中需加入1%的乙酸，且凈化材料用量較大，所以本實(shí)驗(yàn)采用EN提取方法。

2.3 與傳統(tǒng)QuEChERS方法的比較

本研究將自動(dòng)QuEChERS方法與傳統(tǒng)QuECh-ERS方法進(jìn)行了回收率的比較。傳統(tǒng)方法步驟：準(zhǔn)確稱取5 g玉米于50 mL離心管中，加入混標(biāo)溶液，靜置30 min，加入10 mL水渦旋混勻，靜置30 min，加入10 mL乙腈。加入EN萃取鹽包及1顆陶瓷均質(zhì)子，擰緊蓋子，劇烈振蕩1 min，于8000 r·min-1下離心5 min，取6 mL上清液到凈化用離心管中，渦旋混勻1 min，于 8000 r·min-1下離心5 min。取上清液1 mL過0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。圖5給出了兩種方法在3個(gè)添加濃度下的回收率比較。從圖中可以看出，自動(dòng)QuEChERS方法與傳統(tǒng)QuEChERS方法回收率相差不大，幾乎所有受測(cè)農(nóng)藥回收率在70%～120%之間，通過兩種方法的比較，進(jìn)一步說明了自動(dòng)QuEChERS方法在玉米農(nóng)藥多殘留分析中的可行性和適用性。

表2 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Optimized chromatographic parameters for the selected antibiotics

續(xù)表2目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Continued table 2 Optimized chromatographic parameters for the selected antibiotics

續(xù)表2目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Continued table 2 Optimized chromatographic parameters for the selected antibiotics

圖3 不同振蕩時(shí)間下玉米中133種農(nóng)藥的回收率比較Figure 3 Recoveries of 133 pesticides in corn at different oscillation time

圖4 EN和AOAC提取方法得到的玉米提取化合物色譜圖Figure 4 The chromatogram of corn extracts using EN and AOAC method

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

圖5 傳統(tǒng)方法和自動(dòng)方法在3個(gè)添加水平時(shí)的回收率箱圖Figure 5 Boxplot of the recovery values obtained with the manual method and automatic method at three spiking level

式中：Sm和Ss分別表示基質(zhì)標(biāo)曲和溶劑標(biāo)曲的斜率，當(dāng)ME為-20%～20%、-50%～-20%或 20%～50%、＜-50%或＞50%時(shí)，分別表示輕微、中等、較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。本研究基質(zhì)效應(yīng)（圖6）的評(píng)估結(jié)果表明，69%受測(cè)農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)在-20%～20%，屬于弱基質(zhì)效應(yīng)；而溴氰菊酯、芐氯菊酯等農(nóng)藥表現(xiàn)為中等或強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，所以在定量分析中使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校正曲線是必要的。

2.5 方法驗(yàn)證

在實(shí)驗(yàn)中，通過回收率、線性、定量限對(duì)自動(dòng)QuEChERS方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

待測(cè)農(nóng)藥 3 個(gè)添加濃度為 20、100、500 μg·kg-1，每一濃度5個(gè)平行，得到的回收率在70%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于15%。

用玉米空白基質(zhì)配制 8個(gè)濃度水平（2、5、10、20、50、100、200、500 μg·kg-1），通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，呈現(xiàn)良好的線性，相關(guān)系數(shù)在0.990～0.999。

圖6 在玉米基質(zhì)中受測(cè)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)Figure 6 Matrix effects（ME）of the test pesticides in corn

本實(shí)驗(yàn)以目標(biāo)化合物回收率在70%～120%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%時(shí)的最小添加濃度為定量限，在對(duì)玉米133種農(nóng)藥檢測(cè)結(jié)果中，有119種農(nóng)藥的定量限為 2 μg·kg-1，相比 He 等[16]所報(bào)道的更低。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)山東省10個(gè)玉米樣品（S-1～S-10），采用自動(dòng)QuEChERS方法進(jìn)行農(nóng)藥殘留測(cè)定。其中S-3、S-5、S-6、S-9中未檢出農(nóng)藥殘留，S-1中莠去津、乙草胺有檢出，濃度分別為 20.8 μg·kg-1和 10.1 μg·kg-1；S-2中乙草胺檢出濃度為6.2 μg·kg-1，毒死蜱檢出濃度低于檢出限；S-4 檢出甲草胺 16.2 μg·kg-1，毒死蜱2.7 μg·kg-1，S-7 檢出甲草胺 4.2 μg·kg-1，三唑酮 3.1 μg·kg-1，除蟲脲 2.7 μg·kg-1，克百威低于檢出限；S-8中檢出莠去津、氯蟲苯甲酰胺濃度分別為9.8、4.6 μg·kg-1；S-10 中檢出 3-羥基克百威 2.9 μg·kg-1，莠去津8.3 μg·kg-1。結(jié)果表明，本方法適用于玉米中農(nóng)藥殘留的測(cè)定。

3 結(jié)論

（1）在本研究中，通過對(duì)提取方法的比較、提取時(shí)間的優(yōu)化，以及方法的驗(yàn)證，建立了自動(dòng)QuEChERS結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)玉米中133種農(nóng)藥的多殘留分析方法。

（2）通過與傳統(tǒng)QuEChERS方法的比較，該方法耗時(shí)短、效率高，受測(cè)農(nóng)藥總體回收率在70%～120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在15%以下，符合殘留檢測(cè)的要求。

（3）該方法成功應(yīng)用于玉米實(shí)際樣品的檢測(cè)，為玉米中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)提供方法依據(jù)。

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