GBE對大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞TGF-β、CTGF及α-SMA過表達(dá)的抑制作用

韓 璐，胡 濤，丁雪峰，楊 玉

(吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.內(nèi)分泌科，吉林 吉林132000)

腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞是腎臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要生成細(xì)胞。高糖等因素在體內(nèi)體外均可刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖，并刺激其合成并分泌膠原(collagen)、纖連蛋白(FN)及彈性蛋白等在內(nèi)的多種ECM成分，參與腎間質(zhì)纖維化過程。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)被認(rèn)為是強(qiáng)效的致纖維化因子，在腎間質(zhì)纖維化中起重要作用。有研究表明，糖尿病大鼠腎臟二者表達(dá)明顯高于正常對照組，表明二者可能在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1,2]。免疫組化研究顯示，注射脲鏈佐菌素(STZ)4 w后，大鼠腎臟α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)也明顯增加，這可能與成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化作用有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞(MFB)的轉(zhuǎn)分化數(shù)量可作為判斷腎間質(zhì)纖維化程度的主要指標(biāo)[3]。銀杏葉提取物(GBE)是銀杏的干燥葉提取物，具有保護(hù)心腦血管、改善外周血液循環(huán)及降低血清膽固醇等藥理作用。李相軍等發(fā)現(xiàn)，GBE可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠腎成纖維細(xì)胞增殖及ECM分泌，并能下調(diào)TGF-β及CTGF mRNA表達(dá)[4,5]。本研究旨在探討GBE對大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞TGF-β、CTGF及α-SMA過表達(dá)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞株NRK49f購自上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖及低糖培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品，胎牛血清產(chǎn)自天津?yàn)笊锛夹g(shù)公司。GBE注射液由三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格5 ml:17.5 mg，含銀杏黃酮苷4.2 mg。兔抗大鼠TGF-β、CTGF及α-SMA多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ECL顯色試劑盒為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品。細(xì)胞裂解液、Bradford 法蛋白檢測試劑盒由碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)。

1.2細(xì)胞分組將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按1×106/孔接種至6孔板，分為對照組、高糖組及12.5 mg/L和25 mg/L GBE處理組。對照組細(xì)胞用無血清DMEM培養(yǎng)，高糖組及12.5 mg/L和25 mg/L GBE處理組，則分別用含GBE終濃度為0、12.5和25 mg/L的無血清高糖DMEM培養(yǎng)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)現(xiàn)重復(fù)3次。

1.3WesternBlot檢測培養(yǎng)結(jié)束后，以冷磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌細(xì)胞2次，每孔加300 μl細(xì)胞裂解液反復(fù)吹打以充分裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白定量后按50 μg/孔行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳并經(jīng)轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉后，用兔抗大鼠TGF-β、CTGF及α-SMA多克隆抗體4℃孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔多克隆抗體37℃孵育2 h，充分洗膜后用ECL法顯色、曝光后測量X光膠片上條帶密度。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞TGF-β和CTGFwesternblot檢測結(jié)果高糖DMEM作用于NRK49f 24 h后，高糖組細(xì)胞TGF-β、CTGF蛋白表達(dá)量明顯增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與高糖照組比較，GBE各處理組TGF-β、CTGF表達(dá)量明顯降低，且GBE高劑量組(25 mg/L)二者表達(dá)量明顯低于GBE低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組細(xì)胞TGF-β和CTGF western blot檢測結(jié)果

分組TGF?β/GAPDHCTGF/GAPDH對照組高糖組GBE12．5mg/L 25mg/L1．00±0．151．76±0．25?1．55±0．12Δ1．28±0．08Δ#1．00±0．122．13±0．14?1．65±0．16Δ1．12±0．19Δ#

與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，ΔP<0.05；與GBE低劑量組比較，#P<0.05

2.2各組細(xì)胞α-SMA表達(dá)檢測結(jié)果Western blot檢測結(jié)果顯示，正常組NRK49f細(xì)胞未檢測到α-SMA表達(dá)，高糖DMEM作用于NRK49f 48 h時(shí)可見明顯α-SMA表達(dá)，而GBE2個(gè)劑量組α-SMA表達(dá)量均顯著低于高糖組(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 各組細(xì)胞α-SMA western blot檢測結(jié)果

分組α?SMA/GAPDH對照組高糖組GBE12．5mg/L 25mg/L0．00±0．181．00±0．12?0．46±0．08Δ0．58±0．13Δ

與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，ΔP<0.05。

3 討論

研究表明，高糖可刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖及ECM表達(dá)，糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)中成纖維細(xì)胞明顯增生及ECM生成，腎間質(zhì)TGF-β、CTGF蛋白及mRNA表達(dá)亦明顯增加[6-9]。除降糖作用外，GBE還可通過降低Ⅳ型膠原mRNA等途徑減少改善2型糖尿病大鼠腎臟ECM的過度積聚，延緩糖尿病腎病及腎間質(zhì)纖維化發(fā)生[10]。

TGF-β分子量25 kD，由兩個(gè)分子量為12.5 kD的亞基通過二硫鍵連接而成的同源二聚體，二聚體形式的TGF-β才有生物活性。現(xiàn)已證明，TGF-β是腎間質(zhì)纖維化過程中最重要的生長因子之一，在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)起作用。研究表明，TGF-β除直接刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞ECM產(chǎn)生外，還可通過促進(jìn)纖溶酶原激活物抑制物(PAI)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)的合成而減少ECM降解。CTGF是在TGF-β下游起作用的介質(zhì)。在CTGF啟動(dòng)子上有一個(gè)特殊的TGF-β反應(yīng)元件，TGF-β通過此元件誘導(dǎo)CTGF表達(dá)，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的形成。楊敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CTGF可修飾或放大TGF-β1的促成纖維細(xì)胞生成作用。本研究中，高糖培養(yǎng)液作用于NRK49f 24 h后，可見TGF-β和CTGF蛋白表達(dá)量明顯增加，而GBE對此二者有明顯降低作用，表明TGF-β、CTGF通路可能參與高糖所致的腎間質(zhì)纖維化形成，而抑制其生成與活性可能是GBE腎臟保護(hù)機(jī)制之一。

α-SMA是常用的肌細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白，常用于平滑肌細(xì)胞的鑒定。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β、CTGF均可刺激大鼠腎臟成纖維細(xì)胞合成向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，即由本來不表達(dá)α-SMA的腎小管成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為有α-SMA表達(dá)的肌成纖維細(xì)胞。本研究中，高糖刺激NRK49f 48 h后，NRK49f α-SMA表達(dá)明顯增加，表明腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞可能是腎間質(zhì)纖維化時(shí)肌成纖維細(xì)胞的來源之一，在培養(yǎng)液中加入GBE后，α-SMA表達(dá)量明顯低于高糖組，表明抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化可能是GBE抗纖維化的另一機(jī)制。

綜上所述，除降糖作用外，GBE還可通過抑制F-CTGF途徑及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化機(jī)制抑制ECM合成，保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)和功能，提示GBE可能在糖尿病治療中有重要應(yīng)用價(jià)值。

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