大蒜素對(duì)小鼠酒精性肝纖維化的預(yù)防作用研究

李娜，周琪，趙鑫，吳曼曼，李新莉

（大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧大連116044）

酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD）是酒精攝入過量或長期酗酒導(dǎo)致的中毒性肝損傷，初期常誘發(fā)脂肪肝，進(jìn)而發(fā)展成酒精性肝炎，損害持續(xù)加重可以發(fā)展為酒精性肝纖維化（Alcohol liver fibrosi，ALF）甚至酒精性肝硬化，最終導(dǎo)致肝功能衰竭[1]。

大蒜素（Allicin）是從蔥科植物大蒜中提取的具有生物活性的含硫化合物總稱，有特殊氣味，具有較好抗菌、調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等功能[2]。大蒜素對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制研究主要集中于抗肝臟氧化損傷作用[3-4]，而對(duì)大蒜素抗肝纖維化的研究罕見報(bào)道。ALF是酒精性脂肪肝、肝炎向肝硬化甚至肝癌發(fā)展的必經(jīng)之路，其發(fā)生機(jī)制是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的過度沉積與分布異常的結(jié)果[5]，肝纖維化可以逆轉(zhuǎn)[6-7]，因此對(duì)其進(jìn)行有效的治療可以阻斷病情的發(fā)展，提高患者的生存率與生命質(zhì)量。

本課題使用56°紅星二鍋頭灌胃小鼠建立酒精性肝纖維化模型，測(cè)定肝功能相關(guān)指標(biāo)，檢測(cè)肝組織中腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factor beta1，TGF-β1）和飾膠蛋白聚糖（Decorin）蛋白的表達(dá)水平，初步探討大蒜素抗肝纖維化的機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)保肝護(hù)肝藥物提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大蒜：市售；護(hù)肝片：長春海外制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：Z22020994，規(guī)格：0.35 g；北京 56°紅星二鍋頭：北京紅星股份有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、 谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、谷胱甘肽（Glutathione GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathion peroxidase，GSHPX）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDLC）測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所；兔源抗β-actin抗體、兔源抗TNF-α抗體、兔源抗TGF-β1抗體、兔源抗Decorin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗體：武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Pierce ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：Thermo公司；硝酸纖維素膜：大連萬澤貿(mào)易有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺：進(jìn)口試劑，上海雙螺旋生物科技有限公司分裝；RIPA裂解液：北京索萊寶科技有限公司；5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5-disulfide（2-nitrobenzoic acid），DTNB）、L-半胱氨酸：美國 sigma公司；其他試劑均為市售分析純：中國藥品上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2 大蒜素的制備

有機(jī)溶劑法[8]提取大蒜素。200 g大蒜去皮搗碎，利用大蒜細(xì)胞破碎后產(chǎn)生的蒜氨酸酶40℃下酶解30 min，按料液比 1 ∶4（g/mL）加入 95%乙醇 800 mL，30℃水浴2 h，雙層紗布過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮得到大蒜素（GA）。DTNB法測(cè)定大蒜素含量[9]。取0.5 mL L-半胱氨酸溶液，加1 mL DTNB溶液，用50 mmol/L pH7.5的Tris-HCl緩沖溶液稀釋至5.0 mL，26℃保溫15 min，412 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)0。取L-半胱氨酸溶液0.5 mL，加0.5 mL 10倍稀釋的大蒜素提取液，26℃保溫15 min加DTNB溶液1 mL，用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至5.0 mL，26℃下保溫15 min，412 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)。大蒜素含量測(cè)定方法如下：

式中：ΔA412=A0-A；d為稀釋倍數(shù)；14150為 NTB在412 nm，1 cm光徑摩爾消光系數(shù)。

1.3 模型建立與分組

SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，體重18 g～22 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2008-0002，本實(shí)驗(yàn)通過大連醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意。護(hù)肝片和大蒜素分別溶于生理鹽水配成護(hù)肝片溶液（6 mg/mL）、大蒜素高濃度（200 mg/mL）和低濃度（50mg/mL）溶液。小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N）、酒精性肝纖維化組（A）、護(hù)肝片組（P）、大蒜素高（GA-H）、低濃度組（GA-L），每組8只。除N組和A組，其余各組灌服相應(yīng)藥物0.2 mL 30 d，末次給藥30 min后，正常對(duì)照組灌胃生理鹽水，其余各組灌胃14mL/kg紅星二鍋頭。

1.4 肝功能指標(biāo)的檢測(cè)

小鼠末次給藥禁食12 h，摘眼球取血，室溫靜置1 h，4℃過夜，3 000 r/min 4℃離心10 min，分離血清，備用，按試劑盒方法測(cè)定血清ALT和AST水平。處死小鼠，約取肝臟同一位置0.5 g，加入9倍質(zhì)量的冷生理鹽水，制成10%的肝組織勻漿，8 000 r/min 4℃離心15 min，取上清液，按試劑盒方法測(cè)定肝臟中TC、TG、GSH、GSH-PX、SOD、MDA、HDL-C 和 LDL-C 等肝功能指標(biāo)。

1.5 小鼠肝臟病理組織學(xué)觀察

取小鼠左葉肝臟，用10%冷甲醛固定，制作石蠟切片，H&E染色，高倍顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化。

1.6 Western-blot檢測(cè) TNF-α、TGF-β1和 Decorin的表達(dá)水平

各組取50 mg～100 mg肝組織在冰浴上剪成碎片，用預(yù)冷的生理鹽水洗滌2次。加入0.5 mL預(yù)冷的蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），勻漿 20次～40次，直到95%的細(xì)胞破碎，在冰浴中放置30 min。12 000 r/min 4℃離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。常?guī)SDS-PAGE電泳，每組肝組織蛋白上樣量為100μg，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，待預(yù)染Marker充分被分開，停止電泳。用半干式電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。脫脂奶粉封閉NC膜1 h。分別與一抗βactin（1 ∶500 稀釋）、TNF-α（1 ∶500 稀釋）、TGF-β1（1 ∶500稀釋）、Decorin（1∶500稀釋）結(jié)合，4℃過夜，TBST洗膜，于二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G多克隆抗體（1∶5000稀釋）孵育2 h，ECL發(fā)光，凝膠成像。以β-actin為內(nèi)參，采用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行蛋白灰度值分析，各蛋白表達(dá)量是與內(nèi)參的比值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析在SPSS 10.0軟件包中處理，正態(tài)計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P值＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜素的制備

采用有機(jī)溶劑法，得到大蒜素GA 14.54 g，產(chǎn)率為7.27%。采用DTNB法測(cè)定大蒜素含量為0.978%。

2.2 肝功能指標(biāo)的檢測(cè)

大蒜素對(duì)小鼠血清ALT和AST的影響見表1。

表1 大蒜素對(duì)小鼠血清ALT和AST的影響（±s，n=8）Table 1 Effect of allicin on serum activity of ALT and AST（±s，n=8）

表1 大蒜素對(duì)小鼠血清ALT和AST的影響（±s，n=8）Table 1 Effect of allicin on serum activity of ALT and AST（±s，n=8）

注：與急性酒精性肝損傷組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組相比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別A L T/（U/L）A S T/（U/L）正常對(duì)照組（N） 5.6 5±0.8 6 2 3.2 2±4.0 9酒精性肝纖維化組（A） 2 0 2.9 6±1 0.8 0## 4 9.1 3±1 0.8 3##護(hù)肝片組（P） 5 6.6 9±2 5.4 0** 3 2.7 1±1.8 2**大蒜素高濃度組（G A-H） 1 2.6 7±3.0 6** 2 3.1 3±1.6 7**大蒜素低濃度組（G A-L） 1 4.5 4±5.3 5** 2 9.5 3±0.4 4**

與正常對(duì)照組相比，酒精性肝纖維化組ALT和AST活性顯著增強(qiáng)（P＜0.01），表明小鼠肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷。與肝纖維化模型組相比，護(hù)肝片、大蒜素高（200 mg/mL）和低（50 mg/mL）濃度組小鼠血清ALT和AST肝功能酶活性顯著降低（P＜0.01），且大蒜素的效果要優(yōu)于護(hù)肝片，以上結(jié)果表明，大蒜素可降低血清中ALT和AST的活性，對(duì)小鼠肝臟具有保護(hù)作用。

大蒜素對(duì)小鼠肝均漿液中 TC、TG、GSH、GSHPX、SOD、MDA、HDL-C、LDL-C 的影響見表 2。

表2 大蒜素對(duì)小鼠肝勻漿液中 TC、TG、GSH、GSH-PX、SOD、MDA、HDL-C、LDL-C 的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of allicin on TC，TG，GSH，GSH-PX，SOD，MDA，HDL-C and LDL-C in liver（±s，n=8）

表2 大蒜素對(duì)小鼠肝勻漿液中 TC、TG、GSH、GSH-PX、SOD、MDA、HDL-C、LDL-C 的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of allicin on TC，TG，GSH，GSH-PX，SOD，MDA，HDL-C and LDL-C in liver（±s，n=8）

注：與急性酒精性肝損傷組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組相比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

L D L-C/（m m o l/L）正常對(duì)照組（N） 1 2 0.6 9±2 8.9 6 1.9 8±0.2 1 7 6.4 5±1 7.2 1 4 8 9.7 4±6 1.9 9 4.2 8±0.3 9 2.9 8±1.3 6 6.2 1±1.3 3 0.0 9 9±0.0 4 5酒精性肝纖維化組（A） 9 0.1 2±1 5.5 0## 4.1 2±1.5 3## 5 0.1 2±1 1.3 2## 2 6 6.1 7±7 3.5 1##5.3 0±1.2 2 3.2 4±0.9 8 5.9 8±1.4 6 0.4 4±0.1 2##護(hù)肝片組（P） 1 1 2.2 3±2 2.2 1** 2.8 5±0.5 3** 8 0.3 2±1 9.1 3** 5 2 3.7 2±7 6.1 1**4.9 6±1.5 4 3.0 5±1.2 0**6.0 7±2.0 2 0.1 6±0.0 5**大蒜素高濃度組（G A-H） 1 1 7.3 5±1 7.3 4** 3.5 8±1.9 7* 7 1.2 1±1 7.5 6** 4 5 0.4 9±5 1.9 8**4.8 9±1.5 4 3.3 3±1.9 7**6.1 4±2.3 1 0.1 3±0.0 2 1**大蒜素低濃度組（G A-L） 9 8.8 9±2 0.4 3 4.0 1±0.6 3 6 5.2 1±2 9.2 1* 2 5 7.8 4±6 3.1 3 5.0 7±0.3 2 3.6 9±1.3 6**5.9 2±2.1 7 0.3 4±0.0 5組別S O D/（U/m g）M D A/（n m o l/m g）G S H/（μ m o l/g）G S H-P x/（U/m g）T C/（m m o l/L）T G/（m m o l/L）H D L-C/（m m o l/L）

與正常對(duì)照組相比，酒精性肝纖維化組小鼠肝均漿液中SOD、GSH-PX活性和GSH含量均顯著減少（P<0.01），而MDA 和 LDL-C含量顯著增加（P<0.01），這表明酒精性肝纖維化組小鼠肝臟受損嚴(yán)重。與酒精性肝纖維化組相比，護(hù)肝片組和大蒜素高濃度（200 mg/mL）組SOD、GSH-PX活性和GSH含量顯著增加（P<0.01），而MDA和LDL-C的含量降低，這表明大蒜素不僅能夠增強(qiáng)肝纖維化組小鼠肝臟抗氧化酶活力，還可顯著降低其肝臟的脂質(zhì)過氧化水平。

2.3 小鼠肝臟病理組織學(xué)觀察結(jié)果

小鼠肝臟切片后，采用H&E染色，在200倍顯微鏡下觀察不同處理組小鼠肝組織損傷情況如圖1所示。

圖1 各組小鼠肝組織切片蘇木伊紅染色結(jié)果（×200）Fig.1 Hematoxylon and eosin（H&E）staining of mice liver tissues lices（Mag.200×）

正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、大小相近，以小葉中央靜脈為中心，胞核大而呈圓形或橢圓形，胞漿染色均勻，未見肝臟病變。模型組小鼠肝小葉界限不清，肝細(xì)胞索紊亂，肝竇變窄，肝細(xì)胞明顯腫脹，部分區(qū)域出現(xiàn)氣球樣變和炎細(xì)胞浸潤，由此可見酒精對(duì)肝臟有明顯的損傷。護(hù)肝片組和大蒜素高濃度組（200 mg/mL）均呈現(xiàn)與酒精性肝纖維化組相似的肝臟病變，但與酒精性肝纖維化組相比，肝細(xì)胞腫脹減輕，細(xì)胞核進(jìn)一步正?；?，小鼠肝組織得到了一定的修復(fù)。

2.4 Western-blotting檢測(cè) TNF-α、TGF-β1和 Decorin的表達(dá)水平

Western-blot檢測(cè)肝組織中 TNF-α、TGF-β1 和Decorin的表達(dá)水平。分析各蛋白條帶灰度，進(jìn)行半定量比較，以目的基因的條帶灰度與管家基因β-actin的灰度比值表示蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示。

圖2 Western-blot法檢測(cè)TNF-α、TGF-β1和Decorin表達(dá)水平及各蛋白與β-actin灰度值比值Fig.2 The expression and gray scale value ratio of TNF-α，TGF-β1 and Decorin

上述結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組（N）比較，酒精性肝纖維化組（A）小鼠肝組織TNF-α和TGF-β1的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），而Decorin的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；與酒精性肝纖維化組相比，護(hù)肝片組、大蒜素高和低濃度組小鼠肝組織中TNF-α的表達(dá)水平降低，大蒜素高和低濃度組TGF-β1的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），且大蒜素高濃度組中Decorin表達(dá)水平升高，具有顯著性的差異。

3 結(jié)論與討論

在已探明的酒精性肝病的損傷機(jī)制中，氧化應(yīng)激是最為關(guān)鍵的影響因素[10]。酒精通過增加活性氧和消耗抗氧化劑而加重氧化應(yīng)激。長期大量酒精的攝入使肝細(xì)胞線粒體內(nèi)GSH含量明顯下降，從而加劇對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損害，飲酒造成營養(yǎng)吸收不良也使食物中的抗氧化劑吸收減少。同時(shí)，酒精在經(jīng)微粒體氧化酶代謝后可生成大量活性氧自由基，引發(fā)脂質(zhì)過氧化。氧負(fù)離子和活性氧自由基可直接氧化生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)，破壞其功能和完整性。脂質(zhì)過氧化可誘導(dǎo)炎細(xì)胞浸潤，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)并激活TNF-α和TGF-β1，激活Kupffer細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cell，HSC），促進(jìn) HSC 分泌眾多細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），導(dǎo)致了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。Decorin作為ECM的一個(gè)主要組分，在正常肝臟中是微量的，隨纖維化進(jìn)展其含量穩(wěn)定增加，具有突出的抑制膠原纖維合成以及負(fù)反饋調(diào)控TGF-β1活性的功能，在TGF-β1功能調(diào)節(jié)中起重要作用[11]。

大蒜素具有多種生物學(xué)功能，對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，目前其機(jī)制研究主要集中于清除自由基，抑制肝臟過氧化等。針對(duì)酒精性肝損傷會(huì)發(fā)展成肝纖維化和肝硬化這一嚴(yán)重問題，本研究建立小鼠酒精性肝纖維化模型，測(cè)定血清ALT和AST等肝功能酶活性，發(fā)現(xiàn)酒精性肝纖維化組小鼠ALT和AST活性顯著增強(qiáng)，護(hù)肝片和大蒜素灌胃后ALT和AST降低。據(jù)報(bào)道，ALT和AST主要存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞明顯損害時(shí)釋放入血，ALT和AST的升高均為反映肝功能受損的特異性指標(biāo)，因此，大蒜素可降低血清中ALT和AST的活性，對(duì)小鼠肝臟具有保護(hù)作用。肝臟中SOD與GSH是機(jī)體中抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，能清除體內(nèi)自由基，從而防止自由基對(duì)機(jī)體的損傷。酒精的代謝產(chǎn)物乙醛與GSH的巰基結(jié)合，使GSH水平進(jìn)一步下降，從而減弱機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化能力。MDA為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，當(dāng)肝臟所受的損傷越嚴(yán)重時(shí)，肝臟內(nèi)的MDA含量越高，故可通過測(cè)定肝組織勻漿中的SOD、GSH和MAD的變化，以評(píng)價(jià)大蒜素的護(hù)肝作用。本試驗(yàn)中護(hù)肝片組和大蒜素高濃度（200 mg/mL）組SOD、GSH-PX活性和GSH含量顯著增加，而MDA和LDL-C的含量降低，這表明大蒜素不僅能夠增強(qiáng)酒精性肝纖維化小鼠肝臟抗氧化酶活力，還可顯著降低其肝臟的脂質(zhì)過氧化水平。小鼠肝組織病理切片也顯示酒精對(duì)肝臟有明顯的損傷，大蒜素使肝細(xì)胞腫脹減輕，細(xì)胞核正常化，小鼠肝組織得到了一定的修復(fù)。本試驗(yàn)繼續(xù)對(duì)大蒜素抗肝纖維化作用展開研究，采用Western blotting方法對(duì)肝臟纖維化的相關(guān)蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示大蒜素灌胃后小鼠肝組織中TNF-α和TGF-β1的表達(dá)水平顯著降低，而Decorin表達(dá)水平升高。

綜上，推測(cè)大蒜素對(duì)酒精性肝纖維化的預(yù)防作用機(jī)制不僅與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力有關(guān)，還與干預(yù)TNF-α、TGF-β1和Decorin等纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。大蒜素能夠促使肝細(xì)胞的抗氧化能力增強(qiáng)，抵御脂質(zhì)過氧化，降低肝細(xì)胞受損程度。TNF-α、TGF-β1和Decorin的表達(dá)是組織ECM異常增多的重要因素，它們?cè)诟螕p傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，這也為我們進(jìn)一步研究預(yù)防酒精性肝損傷的相關(guān)機(jī)制和有效藥物提供新的思路與途徑。

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