響應(yīng)面法優(yōu)化山藥抗性淀粉制備及結(jié)構(gòu)分析

張紅霞 ，金佳幸 ，李炎 ，張玉濤 ，龍菊

（1.安順學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州安順561000；2.貴州省教育廳功能材料與資源化學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州安順561000）

山藥（Dioscorea Opposita）亦稱薯蕷，為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（D.L.）多年生草質(zhì)纏繞藤本植物，其地下塊莖是藥食兼用的經(jīng)濟(jì)作物。安順山藥主要產(chǎn)自貴州省安順市的劉官鄉(xiāng)，因其富含淀粉、口感綿軟、皮薄疏脆、肉質(zhì)細(xì)白、黏液質(zhì)豐富等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者喜愛，同時安順山藥產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價值高。

抗性淀粉（resistant starch，RS）是20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的一種抗消化性淀粉，不能在人體的胃和小腸中消化吸收，可在大腸中被微生物部分發(fā)酵成短鏈脂肪酸及其他產(chǎn)物，具有控制餐后血糖、減少結(jié)腸癌、控制體重及平衡能量等生理功能[1-2]，近年來還發(fā)現(xiàn)抗性淀粉能夠顯著影響腸道菌群的多樣性[3-4]，因此，抗性淀粉在功能性食品開發(fā)中具有重要應(yīng)用價值[5-6]?？剐缘矸鄹鶕?jù)來源可分為四大類，即物理包埋淀粉（RS1）、抗性淀粉顆粒（RS2）、回生淀粉（RS3）和化學(xué)改性淀粉（RS4）[7]。Eerlingen等[8]研究了各因素對抗性淀粉形成的影響，結(jié)果表明，直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例、淀粉糊化工藝等是影響抗性淀粉形成的數(shù)量和質(zhì)量的主要因素。制備抗性淀粉的方法有熱處理法、脫支法、氧化處理法、擠壓膨化處理法等[9]，其中壓熱法由于工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用中較為常用。此外對山藥淀粉化學(xué)組成的分析結(jié)果表明，不同品種的山藥直鏈淀粉含量差異很大[10-12]，目前有關(guān)山藥抗性淀粉的研究主要集中在淮山藥抗性淀粉的制備及理化性質(zhì)研究等方面，對于以富含淀粉的地方特色山藥品種為材料的研究較少，本課題組在前期研究中，采用碘比色法測得安順山藥淀粉百分含量平均為76.0%，說明其可作為抗性淀粉制備的良好原料，因而開展以安順山藥為原料的抗性淀粉制備及結(jié)構(gòu)研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

本文以安順山藥為原料，采用壓熱法制備抗性淀粉，系統(tǒng)研究了淀粉乳百分含量、pH值、壓熱溫度、壓熱時間等因素對抗性淀粉得率的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化了制備抗性淀粉的工藝條件，并應(yīng)用X-射線衍射儀、傅立葉紅外光譜儀和掃描電鏡等大型儀器分析抗性淀粉的結(jié)構(gòu)特征，為安順山藥的精深加工及功能性食品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥：安順西秀區(qū)劉官鄉(xiāng)南翠村，經(jīng)安順學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定為薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea Opposita）的根莖。

胃蛋白酶（3 800 U/mg）、耐熱 α-淀粉酶（380 U/mg）、葡萄糖淀粉酶（10萬U/mL）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氫氧化鉀、鹽酸、葡萄糖、磷酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

D/MAX-2200 X-射線衍射儀：美國利曼公司；PerkinElmer 100傅里葉紅外光譜儀：珀金埃爾默儀器有限公司；Zeiss EVO MA 15型掃描電子顯微鏡：Zeiss公司；UV-5300PC紫外-可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16C離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHA-B恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山藥原淀粉的提取

山藥原淀粉的提取采用堿浸醇提法[13]：山藥洗凈切片→烘干、粉碎過60目篩→0.06 mol/L的氫氧化鈉浸泡8 h（去掉上層懸濁液）→用水多次洗滌至中性→用80%的乙醇于60℃水浴浸提3次，每次15 min→離心（4 000 r/min，離心3 min）→沉淀于60℃烘干后稱重，計(jì)算原淀粉百分含量。

1.3.2 抗性淀粉的制備及單因素試驗(yàn)

抗性淀粉制備的工藝流程[14]：用一定pH值的溶液將山藥原淀粉調(diào)制成一定百分含量的淀粉乳→放入高壓滅菌鍋，壓熱處理→取出自然冷卻→于冰箱中3℃～4℃下老化24 h→在50℃～55℃烘干20 h→粉碎過100目篩，得抗性淀粉。單因素試驗(yàn)見表1，分別考察淀粉乳百分含量、pH值、壓熱溫度、壓熱時間對抗性淀粉得率的影響規(guī)律，以獲得制備工藝參數(shù)的優(yōu)選范圍，試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。

表1 試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of experiment

1.3.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取淀粉乳百分含量、pH值、壓熱溫度和壓熱時間為響應(yīng)因子，以抗性淀粉得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和顯著性檢驗(yàn)，得到多元二次回歸方程，并確定最佳工藝條件。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因子與水平Table 2 Variables and levels in response surface design

1.3.4 抗性淀粉得率的測定和計(jì)算

抗性淀粉得率的測定采用間接測定法[15]：準(zhǔn)確稱取山藥抗性淀粉0.1 g，加入pH值為2.0的緩沖溶液10 mL，加入0.05 g胃蛋白酶，于35℃～37℃恒溫振蕩60 min，除去蛋白質(zhì)，室溫冷卻后加入9 mL pH值為6.9的磷酸緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值至6.0，加入過量的α-淀粉酶，35℃～37℃水浴振蕩16 h，水解可溶性淀粉，冷卻至室溫，5 000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀用蒸餾水洗滌2次，除去葡萄糖，加入4 mL～5 mL 2 mol/L的KOH溶液，混勻，于室溫下不斷振蕩30 min，加入5.5 mL 2 mol/L的HCl中和KOH，加3 mL pH值為4.6的醋酸鈉緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值為4.5，加入葡萄糖淀粉酶0.05 g，60℃恒溫水浴振蕩45 min，水解溶解出的淀粉為葡萄糖，冷卻，5 000 r/min離心20 min，收集上清液，重復(fù)水洗3次，合并上清液，用水定容至50 mL。吸取1 mL上述上清液，用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖的量?？剐缘矸鄣寐实挠?jì)算如下：

1.4 山藥抗性淀粉結(jié)構(gòu)表征

在抗性淀粉制備優(yōu)化條件下，加入一定量耐熱α-淀粉酶和葡萄糖苷酶進(jìn)行消化、離心、水洗、烘干，粉碎過100目篩，得較純的抗性淀粉粉末。X-射線衍射分析：Cu射線，加速電壓30 kV，管電流30 mA，測量條件為測量角度 2θ =10°～80°，步寬 2θ =0.04°，掃描速度4°/min；傅立葉紅外光譜分析條件，在500 cm-1～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描；掃描電子顯微鏡：將粉末鍍金后，將樣品放入樣品臺并調(diào)節(jié)樣品表面與標(biāo)尺，旋緊，做掃描分析。

以上試驗(yàn)結(jié)果采用Origin 8和Design Expert 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 淀粉乳百分含量對抗性淀粉得率的影響

在淀粉乳pH值為7.0，壓熱處理溫度115℃，處理時間為1.5 h的條件下，當(dāng)?shù)矸廴榘俜趾繌?%增加到20%時，抗性淀粉得率隨之升高，在淀粉乳百分含量為20%時為最高（圖1）。

適當(dāng)?shù)牡矸廴榘俜趾坑欣诳剐缘矸鄣男纬?；繼續(xù)增加淀粉乳百分含量抗性淀粉得率有所降低，這可能是由于體系中淀粉乳百分含量過高，淀粉溶液黏度大，淀粉顆粒吸脹不充分，壓熱處理時分子間氫鍵破壞不完全，直鏈淀粉分子不易溶出，難以形成雙螺旋結(jié)構(gòu)和重結(jié)晶，導(dǎo)致抗性淀粉得率降低[16-17]。

圖1 淀粉乳百分含量對抗性淀粉得率的影響Fig.1 Effect of starch milk content on resistant starch yield

2.1.2 淀粉乳pH值對抗性淀粉得率的影響

在淀粉乳百分含量為20%，壓熱處理溫度為115℃，處理時間為1.5 h條件下，隨著淀粉乳pH值的增加，抗性淀粉得率先緩慢升高后快速降低，在pH值為7.0時最高（圖2）。

圖2 淀粉乳pH值對抗性淀粉得率的影響Fig.2 Effect of starch milk pH value on resistant starch yield

由于淀粉乳處于中性條件時，淀粉老化速率最快，有利于抗性淀粉的形成[18]；而當(dāng)?shù)矸廴樘幱谄峄蚱珘A性時淀粉分子結(jié)構(gòu)易被破壞，使淀粉分解為短鏈的小分子，壓熱時不適宜形成晶體，從而導(dǎo)致抗性淀粉數(shù)量減少[19]。

2.1.3 壓熱溫度對抗性淀粉得率的影響

在淀粉乳百分含量為20%，淀粉乳pH值為7.0，壓熱處理時間為1.5 h條件下，隨著壓熱溫度升高，抗性淀粉得率逐漸增加，當(dāng)壓熱溫度為115℃時，抗性淀粉得率最高（圖3）。

一定的壓熱溫度有利于抗性淀粉的形成，原因可能是山藥淀粉的膨脹度和溶解度會隨加熱溫度的升高而增加[20]，利于直鏈淀粉分子溶出，然后通過氫鍵和范德華力形成雙螺旋，從而形成晶核，使晶體得以生長，形成抗性淀粉；而繼續(xù)升高壓熱溫度，抗性淀粉得率有所降低，可能是溫度過高時會導(dǎo)致雙螺旋中部分氫鍵斷裂，同時減弱范德華作用力，從而影響抗性淀粉的形成[21]。

圖3 壓熱溫度對抗性淀粉得率的影響Fig.3 Effect of pressure temperature on resistant starch yield

2.1.4 壓熱時間對抗性淀粉得率的影響

在淀粉乳百分含量為20%，淀粉乳pH值為7.0，壓熱溫度為115℃時，當(dāng)壓熱時間低于1.5 h時，隨著壓熱時間延長，抗性淀粉得率增加，而壓熱時間大于1.5 h時，抗性淀粉得率則緩慢減少（圖4）。

圖4 壓熱時間對抗性淀粉得率的影響Fig.4 Effect of pressure time on resistant starch yield

壓熱時間過短時，直鏈淀粉分子不能充分游離出來，減少了分子相互接近的幾率，影響晶核的形成；而壓熱時間過長，會造成淀粉分子過度降解，形成部分小的直鏈淀粉分子，這些分子運(yùn)動劇烈，不易聚集，因而不利于抗性淀粉的形成[22]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 3 Response surface experimental design and results

通過分析表3數(shù)據(jù)，得到各因素與響應(yīng)值之間的多元二次回歸方程為：

利用Design-Expert軟件對表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到方差分析及回歸方程顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 4 Test of significance for regression equation coefficients

續(xù)表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Continue table 4 Test of significance for regression equation coefficients

由表4可知，整體模型差異極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)差異不顯著（P=0.093 2＞0.05），R2Adj=0.829 5，R2=0.914 7，說明二次回歸模型與實(shí)際情況擬合較好，該模型能夠反應(yīng)響應(yīng)值的變化，可用來對壓熱法制備山藥抗性淀粉工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

分析表4的P值可知，在本試驗(yàn)所取因素水平范圍內(nèi)，各因素對抗性淀粉得率的影響依次為：壓熱溫度＞壓熱時間＞淀粉乳百分含量＞pH值。該模型中一次項(xiàng) C 極顯著（P＜0.01）、D 顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)僅有CD的影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng) D2極顯著（P≤0.01），A2、C2顯著（P＜0.05）。

圖5是通過響應(yīng)面分析淀粉乳百分含量、pH值、壓熱時間和壓熱溫度中任意兩個因子固定不變（0水平）時，其余兩個因子對抗性淀粉得率的影響。

圖5 各因素交互作用對山藥抗性淀粉得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 The interaction effects of various factors on the response surface of the yam resistance

從表4的P值和圖5可知，在壓熱時間和淀粉乳pH值不變時，抗性淀粉得率隨壓熱溫度升高而降低，隨淀粉乳百分含量升高而降低，但二者的交互作用影響不顯著；在壓熱溫度和淀粉乳pH值不變時，抗性淀粉得率隨著壓熱時間的延長先升高后降低，隨淀粉乳百分含量增加有所降低，但降低不顯著，且二者的交互作用影響也不顯著；在淀粉乳百分含量及pH值不變時，隨著壓熱溫度的升高，抗性淀粉得率逐漸降低，而隨著壓熱時間的延長，抗性淀粉得率先升高后降低，二者的交互作用對抗性淀粉得率的影響顯著，說明在一定的壓熱溫度下，保持一定的壓熱時間有利于抗性淀粉的形成，原因可能是壓熱時間過長導(dǎo)致部分淀粉分子發(fā)生一定程度的降解，產(chǎn)生一些相對分子質(zhì)量小的短鏈直鏈淀粉[23]，影響了抗性淀粉晶體的形成。

2.2.2 最佳條件預(yù)測及驗(yàn)證

通過回歸模型的預(yù)測，得到壓熱法制備山藥抗性淀粉的最佳理論條件為淀粉乳百分含量14.16%，pH值6.0，壓熱溫度111.66℃，壓熱時間1.47 h，在此條件下預(yù)測抗性淀粉得率為24.92%。結(jié)合實(shí)際將制備條件調(diào)整為淀粉乳百分含量14%，pH值6.0，壓熱溫度112℃，壓熱時間1.5 h，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，實(shí)際測得抗性淀粉得率為24.83%，與理論預(yù)測值24.92%比較相差0.36%，說明該模型可以有效的預(yù)測最優(yōu)工藝條件。

2.3 山藥抗性淀粉結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 X-射線衍射（XRD）分析

淀粉顆粒的結(jié)晶區(qū)在X射線衍射圖中呈現(xiàn)出尖峰特征，而非結(jié)晶區(qū)呈現(xiàn)彌散特征。圖6為山藥抗性淀粉、山藥原淀粉及玉米淀粉的XRD譜圖。

圖6 淀粉X-射線衍射圖Fig.6 XRD spectra of starch

由圖6可知，山藥原淀粉及玉米淀粉在2θ為15.3、17.2、18.6、23.3°處出現(xiàn)了淀粉的特征衍射峰，為典型的A型淀粉特征[24]；而山藥抗性淀粉僅在2θ為32.8、39.8、42.9、53.8°處出現(xiàn)尖銳的特征衍射峰，明顯不同于山藥原淀粉和玉米淀粉，表現(xiàn)為特征衍射峰的消失和新衍射峰的形成，這可能是由于在壓熱及老化過程中導(dǎo)致原淀粉顆粒的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，進(jìn)一步說明了抗性淀粉的晶體是在壓熱和冷卻老化過程中重新聚合形成的[25]。

2.3.2 紅外光譜（FT-IR）分析

圖7為玉米淀粉、山藥原淀粉和山藥抗性淀粉的紅外光譜圖。

圖7 淀粉傅里葉紅外光譜圖Fig.7 FT-IR spectra of starch

由圖 7 可知，3 種淀粉均在 3 440、2 917、1 650、1 160、995 cm-1附近出現(xiàn)淀粉的特征吸收峰，分別歸屬為羥基締合的O-H伸縮吸收峰、飽和C-H的振動吸收峰、醛基的C=O的吸收峰、與伯、仲醇-OH相連接的C-O的吸收峰、C-OH的彎曲振動吸收峰；通過3種淀粉比較分析可知，山藥抗性淀粉在2 917、995 cm-1處的吸收峰有所減弱，這可能是由于山藥經(jīng)壓熱處理后醛基及分子間羥基所形成的氫鍵被破壞；在930 cm-1附近抗性淀粉沒有出現(xiàn)明顯的D-吡喃葡萄糖I型吸收峰，表明葡萄糖環(huán)結(jié)構(gòu)也被破壞了，與張麗芳等的結(jié)果一致[26]。綜合上述分析可知，山藥經(jīng)壓熱處理后與原淀粉結(jié)構(gòu)相似，沒有生成新的基團(tuán)，表明壓熱法制備山藥抗性淀粉主要發(fā)生了物理變化。

2.3.3 顆粒形貌分析

玉米淀粉、山藥原淀粉與山藥抗性淀粉的SEM表征結(jié)果見圖8。

圖8 玉米淀粉（a）、山藥原淀粉（b）與山藥抗性淀粉（c）的SEM圖Fig.8 SEM images of corn starch（a），yam starch（b）and yam resistant starch（c）

從圖8可見，玉米淀粉為表面光滑的不規(guī)則球形或橢球形（圖8a）；山藥原淀粉顆粒多呈橢球形，表面光滑（圖8b）；而山藥抗性淀粉顆粒形態(tài)發(fā)生了顯著改變，為不規(guī)則片層狀堆積的塊狀晶體，且表明較粗糙不平（圖8c），與謝濤等[27]的研究結(jié)果一致，結(jié)合XRD、FT-IR的分析，說明淀粉分子經(jīng)壓熱處理時氫鍵斷裂，原有晶體結(jié)構(gòu)被破壞，說明壓熱法制備的抗性淀粉是淀粉分子重新聚集而成的有序結(jié)晶。另外，該晶體呈片層狀堆積的原因可能是壓熱溶出的螺旋狀淀粉分子鏈在相互垂直的兩個方向上分別延伸與折疊，從而形成二維片層狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)阻止了淀粉酶活性基團(tuán)的結(jié)合部位與淀粉分子的結(jié)合，這種淀粉顆粒就不能完全被淀粉酶作用，因而產(chǎn)生了抗酶解性[28-29]。

3 結(jié)論

采用壓熱法制備了安順山藥抗性淀粉，考察了各單因素對抗性淀粉得率的影響，在此基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用響應(yīng)面分析結(jié)果結(jié)合實(shí)際值，確定了最佳工藝條件為：淀粉乳百分含量為14%，pH值為6.0，壓熱溫度為112℃，壓熱時間為1.5 h。在此條件下，抗性淀粉得率為24.83%，與理論模型預(yù)測值24.92%高度相符。另外，通過X-射線衍射、紅外光譜及掃描電鏡對制備的抗性淀粉進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，分析表明壓熱處理沒有形成新的化學(xué)官能團(tuán)，但破壞了原淀粉晶體的部分結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致淀粉顆粒原有晶體結(jié)構(gòu)的改變，溶出的淀粉分子重新聚合形成大小不一、表面粗糙的片層狀結(jié)晶顆粒，使晶體具有一定抗酶解性。試驗(yàn)結(jié)果表明壓熱法能較好的適用于安順山藥抗性淀粉的制備，且該法具有生產(chǎn)成本低廉、設(shè)備及試劑易得、操作簡單、提取率較高等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的應(yīng)用前景。

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