穩(wěn)定敲低NLRP3基因的小鼠巨噬細(xì)胞系的建立與鑒定①

李曉瑞 游雷鳴 陳丹軍 任睿芳 安 辰 張海麗 吳 珺 郝 鈺

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系,北京 100029)

巨噬細(xì)胞(Macrophages,Mφ)是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要免疫細(xì)胞之一，它在病原微生物和衰老細(xì)胞的清除，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答以及組織損傷后的修復(fù)與重構(gòu)過程中起關(guān)鍵作用[1]。內(nèi)源性或外源性的多種刺激能引起巨噬細(xì)胞活化，特別是細(xì)胞中NLRP3炎性體的活化，產(chǎn)生大量的促炎性細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-18、IL-6、IL-8及TNF-α等[2,3]。另外，巨噬細(xì)胞分泌的趨化因子，還可以招募大量的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向炎癥部位遷移，以加重炎癥反應(yīng)。NLRP3是包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的固有免疫細(xì)胞中的一種重要胞內(nèi)模式識別受體(Pattern recognition receptor,PRR)，可被細(xì)胞內(nèi)的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMP)或者損傷相關(guān)分子模式(Damage-associated molecular pattern,DAMP)刺激而活化[4,5]。與NLRP3相關(guān)的炎癥小體(稱為NLRP3炎性體)是最近研究較廣泛的炎癥小體，其在炎癥反應(yīng)的發(fā)生中有重要的作用。NLRP3炎性小體是由支架蛋白NLRP3，接頭蛋白ASC和效應(yīng)分子pro-Caspase-1相互結(jié)合而形成的復(fù)合物。胞內(nèi)活化的NLRP3分子可招募接頭分子ASC，使與ASC結(jié)合的無活性的pro-Caspase-1蛋白水解為有活性Caspase-1(又稱為白介素轉(zhuǎn)換酶)，活性Caspase-1結(jié)合并切割pro-IL-1β和pro-IL-18細(xì)胞因子前體分子，使其成為成熟的IL-1β和IL-18分泌出胞外，以介導(dǎo)并放大炎癥反應(yīng)[6-8]。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體作為先天性免疫的重要組分，在免疫反應(yīng)，特別是過度炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病的發(fā)生過程中，有極其重要作用[9,10]。因此，一個(gè)NLRP3炎性體缺損的免疫細(xì)胞模型，特別是NLRP3炎性體缺損的巨噬細(xì)胞模型，對于探究免疫細(xì)胞中NLRP3炎性體活化途徑及其介導(dǎo)的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是急需的。所以，本研究利用shRNA(small hairpin RNA)介導(dǎo)的基因沉默策略，設(shè)計(jì)并篩選靶向小鼠NLRP3基因的有效shRNA序列，并構(gòu)建帶GFP熒光和Neomycin抗性的雙標(biāo)記RNA干擾載體(靶向小鼠NLRP3基因的shRNA表達(dá)載體)[11,12]。該載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后，通過GFP熒光標(biāo)記和G418抗性篩選NLRP3基因穩(wěn)定沉默的巨噬細(xì)胞克隆，即NLRP3炎性體缺損的小鼠巨噬細(xì)胞模型，這將為進(jìn)一步探究NLRP3炎癥小體在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，特別是NLRP3炎癥體活化及其介導(dǎo)的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人胚腎細(xì)胞系HEK293T、小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，由北京中醫(yī)藥大學(xué)免疫與病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA Ladder、原核感受態(tài)細(xì)胞DH-5α均購自TaKaRa公司。RNA提取試劑(TRIZOL)、核酸轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine2000)以及真核細(xì)胞抗生素G418，均購自Invitrogen公司。高保真DNA聚合酶(KOD FX Neo)、SYBgreen熒光定量PCR試劑盒，購自ToYoBo公司。PCR引物采用Primer 5.0設(shè)計(jì)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T及RAW264.7細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。

1.2.2shRNA設(shè)計(jì) 利用shRNA設(shè)計(jì)軟件(OligoEngine Workstation 2)，對小鼠NLRP3編碼基因(UCSC:uc007jei.1,1-3102 bp)序列進(jìn)行了掃描，從候選shRNA序列中挑選出4個(gè)靶點(diǎn)區(qū)二級結(jié)構(gòu)簡單，特異性高且GC含量合理shRNA序列(表1、圖1A)。

1.2.3shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)設(shè)計(jì)好的shRNA序列合成對應(yīng)的可以互補(bǔ)的寡核苷酸單鏈，兩端分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，將可以互補(bǔ)的兩條寡核苷酸鏈(終濃度各120 ng/μl)在退火緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,pH7.5～8.0,50 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA)中，按程序(95℃ 3 min，94℃降到25℃且保持每90 s降低一度)在PCR儀中退火后形成帶黏末端的雙鏈DNA，連接到pGH1表達(dá)載體的pGH1表達(dá)載體的H1啟動(dòng)子(human H1 RNA promoter)的下游(利用BgLⅡ，XhoⅠ酶切位點(diǎn)插入)，構(gòu)建成可以穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)目的shRNA的真核表達(dá)載體(圖 1B)，并對構(gòu)建的4個(gè)shRNA表達(dá)載體分別進(jìn)行測序鑒定，以保證插入shRNA表達(dá)載體的shRNA編碼序列正確如設(shè)計(jì)。構(gòu)建的含靶向NLRP3基因shRNA編碼框的干擾載體分別命名為pGH1-shRNA398、pGH1-shRNA 556、pGH1-shRNA11-69和pGH1-shRNA1832。

表1設(shè)計(jì)合成的引物

Tab.1Primersdesignedandsynthesizedinthisstudy

PrimersSequence(5′to3′)sh398＿topGATCCccGCAGGAGCGGGAGCATGAATTCAAGAGATTCATGCTCCCGCTCCTGCTTTTTggaaCsh398＿botTCGAGttccAAAAAGCAGGAGCGGGAGCATGAATCTCTTGAATTCATGCTCCCGCTCCTGCggGsh556＿topGATCCccCCATCCTAGCCAGGAAGATTTCAAGAGAATCTTCCTGGCTAGGATGGTTTTTggaaCsh556＿botTCGAGttccAAAAACCATCCTAGCCAGGAAGATTCTCTTGAAATCTTCCTGGCTAGGATGGggGsh1169＿topGATCCccGACCACTACGGCCGTCTACTTCAAGAGAGTAGACGGCCGTAGTGGTCTTTTTggaaCsh1169＿botTCGAGttccAAAAAGACCACTACGGCCGTCTACTCTCTTGAAGTAGACGGCCGTAGTGGTCggGsh1832＿topGATCCccCCTCTCTACCAGAATGGACTTCAAGAGAGTCCATTCTGGTAGAGAGGTTTTTggaaCsh1832＿botTCGAGttccAAAAACCTCTCTACCAGAATGGACTCTCTTGAAGTCCATTCTGGTAGAGAGGggGH1scan?FTATCTTAACGCGTGAATTCGAACGCTGACH1scan?RATATTAACGCTTACAATTTACGCGTAAGCNLRP3CDS?FaatAAGCTTGccAccATGACGAGTGTCCGTTGCAAGCTGGCTCNLRP3CDS?RaatCTCGAGCCAGGAAATCTCGAAGACTATAGTCAGCqR＿NLRP3?FATCTTTGCTGCGATCAACAGGCGqR＿NLRP3?RCGCGTTCCTGTCCTTGATAGAGTqR＿GAPDH?FggtgaaggtcggtgtgaacgqR＿GAPDH?Rctcgctcctggaagatggtg

1.2.4小鼠NLRP3基因克隆以及NLRP3-GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建 用RNA提取試劑(Trizol)，按使用說明收集培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞分離總RNA，提取的RNA經(jīng)DNA酶消化處理后測定濃度。取約1 μg RNA，用Oligo d(T)18引物，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)的操作說明，合成20 μl cDNA溶液。取1 μl 的cDNA溶液作為模板，加引物NLRP3CDS-F(10 μmol/L)和NLRP3CDS-R(10 μmol/L)各0.5 μl，在25 μl體系中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 條件如下：先95℃預(yù)變性 4 min，然后擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 80 s)后，于72℃延伸6 min，4℃保存。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，按膠回收試劑盒(TaKaRa)說明，割膠回收約1 500 bp的NLRP3基因條帶?；厥盏腜CR片段經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后，連接到同酶切的pCMVGFP載體上構(gòu)建成NLRP3-GFP融合表達(dá)重組載體(pCMVGFP-NLRP3)，并送上海生工測序鑒定。

1.2.5shRNA有效性檢測 以pGH1-shRNA398、pGH1-shRNA556、pGH1-shRNA1169和pGH1-shRNA 1832重組質(zhì)粒為模板，用引物H1scanF和H1scanR，PCR分別擴(kuò)增出含H1啟動(dòng)子的shRNA表達(dá)框片段。將擴(kuò)增的4個(gè)shRNA表達(dá)框片段，分別與pCMVGFP-NLRP3載體(前面構(gòu)建的NLRP3基因與EGFP融合表達(dá)載體)共轉(zhuǎn)染人HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞利用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的GFP表達(dá)情況，篩選出能抑制NLRP3基因表達(dá)的最佳shRNA序列(由于NLRP3與GFP是融合表達(dá)的，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的GFP表達(dá)越少代表shRNA對NLRP3表達(dá)的抑制能力越強(qiáng))。

1.2.6shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞及NLRP3穩(wěn)定敲低細(xì)胞的分選和富聚 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染之前，需先確定G418藥物對RAW264.7細(xì)胞的最小致死濃度，其過程大致如下：首先將RAW264.7細(xì)胞按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到24孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，并依次加入適量G418抗生素，使細(xì)胞培養(yǎng)孔中G418終濃度分別為0、50、100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 500 μg/ml。連續(xù)培養(yǎng)7 d并觀察細(xì)胞的生長情況，1周之內(nèi)巨噬細(xì)胞完全死亡的G418濃度為800 μg/ml，將其作為后續(xù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的藥物篩選參考濃度。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)，先將正常的RAW264.7細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞濃度長至70%～80%時(shí)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000按操作說明，將酶切線化處理的shRNA表達(dá)載體(事先用ApaLⅠ酶切并純化)穩(wěn)定RAW264.7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后將轉(zhuǎn)染孔細(xì)胞消化，1∶10稀釋后，接種到24孔板并換G418(800 μg/ml)抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)，7 d后更換為G418(600 μg/ml)維持培養(yǎng)基繼續(xù)篩選。待抗性克隆細(xì)胞生長到量足夠多時(shí)，消化各孔細(xì)胞并混合，PBS離心清洗后，利用GFP標(biāo)記通過流式細(xì)胞儀進(jìn)一步純化和富聚穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，得到的混合克隆細(xì)胞(命名為RAWNKD)，即NLRP3穩(wěn)定敲低缺損NLRP3炎性體的小鼠巨噬細(xì)胞系(圖 2)。

1.2.7小鼠NLRP3基因穩(wěn)定敲低巨噬細(xì)胞系的鑒定 將RAW264.7巨噬細(xì)胞和建立的RAWNKD巨噬細(xì)胞分別接種到6孔板中，兩種細(xì)胞分別設(shè)置，非刺激對照組、LPS(脂多糖)+ATP(三磷腺苷)聯(lián)合刺激組，每組3個(gè)重復(fù)。待細(xì)胞濃度長至70%～80%，對照組不做處理，刺激組加LPS(終濃度1 μg/ml)刺激4 h后再加入ATP(終濃度5 mmol/L)共刺激0.5 h。去除培養(yǎng)基并用PBS清洗各組各孔細(xì)胞2次，每空加1 ml的TRIZOL試劑裂解細(xì)胞分離純化各孔細(xì)胞總RNA，測定濃度備用。提取的各孔RNA經(jīng)DNA酶消化處理后，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ToYoBo)的操作說明，取適量RNA配制逆轉(zhuǎn)錄體系(10 μl反轉(zhuǎn)錄體系中加入RNA 1 μg，5×RT Buffer 2 μl，RT Enzyme Mix 0.5 μl，Primer Mix 0.5 μl，Nuclease-free Water補(bǔ)足到10 μl)，按程序(37℃ 30 min,98℃ 5 min)合成cDNA，各組cDNA加入90 μl 去離子水(即10倍稀釋)備用。按qPCR試劑盒(ToYoBo)的操作說明，取1μl稀釋的cDNA為模板，以小鼠GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，用引物qR_NLRP3-F和qR_NLRP3對各組細(xì)胞NLRP3基因的mRNA水平進(jìn)行相對定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每個(gè)研究至少重復(fù)2次，每組3個(gè)平行樣品，結(jié)果數(shù)據(jù)為平均值。采用χ2檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1靶向小鼠NLRP3基因的最佳shRNA序列及對應(yīng)的shRNA表達(dá)載體 OligoEngine公司的small interference RNA(siRNA)預(yù)測評估軟件(OligoEgine Workstation 2)是一個(gè)基于NCBI(National Center of Biological information)數(shù)據(jù)庫的siRNA預(yù)測分析軟件。它可以在候選序列中找到高物種特異性，高抑制效果且GC含量合理的siRNA序列，并可以對siRNA靶點(diǎn)所在二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和實(shí)時(shí)展示，這是高效siRNA序列低空間位阻的重要參考依據(jù)，并可自動(dòng)生成shRNA序列，本文中設(shè)計(jì)的4個(gè)靶向NLRP3基因的shRNA序列就在低二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域(圖 1A)。利用PCR方法獲得包含H1啟動(dòng)子的shRNA表達(dá)框片段與pCMVGFP-NLRP3載體(測序確認(rèn)正確的，NLRP3基因與EGFP融合表達(dá))共轉(zhuǎn)染人HEK293T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上的GFP表達(dá)分析顯示(圖 1C、D)，能抑制NLRP3基因表達(dá)的最佳shRNA序列為5′-GACCACTACGGCCGTCTAC-3′，而包含該shRNA編碼框的雙標(biāo)記表達(dá)載體為pGH1-sh1169。

圖1 靶向NLRP3基因的shRNA設(shè)計(jì)及有效shRNA的篩選Fig.1 Design and selection of effective shRNAs targetting mouse NLRP3 geneNote:A.shRNA target sites in NLRP3 mRNA；B.Construction of the dual-marker shRNA expression vector containing a customized shRNA-coding frame；C.Comparison for percentage of GFP-positive cells；D.Histogram analysis of FACS (fluorescence-activated cell sorting) for shRNA-mediated inhibition of NLRP3-GFP fusion expression.The region (GFP+ cells) defines the GFP-positive cells.Compared with the negative control shRNA (shmock)，shRNA (sh1169) is more efficient in inhibiting the fusion expression of NLRP3-GFP.

2.2聯(lián)用GFP標(biāo)記和Neomycin抗性標(biāo)記快速篩選NLRP3基因穩(wěn)定敲低的細(xì)胞 使用脂質(zhì)體將ApaLⅠ線化的pGH1-sh1169 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞， 1 d后可見GFP熒光表達(dá)，但熒光比例并不高(RAW264.7細(xì)胞屬于比較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型)。改換G418抗性培養(yǎng)基篩選后，1周內(nèi)大部分細(xì)胞死亡，約16 d時(shí)出現(xiàn)發(fā)熒光的G418抗性細(xì)胞，隨后熒光細(xì)胞分裂且數(shù)量迅速增多?？剐约?xì)胞經(jīng)流式分選富聚后，得到了GFP陽性率更高的穩(wěn)定巨噬細(xì)胞群，命名為RAWNKD細(xì)胞(該細(xì)胞基因組穩(wěn)定整合了外源的質(zhì)粒DNA，所以可表達(dá)GFP標(biāo)記和Neomycin抗性標(biāo)記基因，且能在H1啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下持續(xù)轉(zhuǎn)錄靶向NLRP3基因的shRNA)。這種RAWNKD巨噬細(xì)胞既能抵抗G418抗生素又帶GFP標(biāo)記(圖2C)，同時(shí)胞內(nèi)持續(xù)轉(zhuǎn)錄的shRNA可穩(wěn)定干擾沉默NLRP3基因表達(dá)。

2.3RAWNKD巨噬細(xì)胞系NLRP3基因的穩(wěn)定敲低 如圖2D所示，與正常的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7相比，建立的RAWNKD細(xì)胞的NLRP3基因的mRNA幾乎檢測不到。即使用細(xì)菌脂多糖類似物L(fēng)PS聯(lián)合ATP來模擬體內(nèi)感染和損傷刺激，RAWKDN細(xì)胞內(nèi)NLRP3基因的mRNA水平上升也不明顯，不僅低于正常巨噬細(xì)胞的NLRP3基因mRNA水平，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于LPS刺激的正常巨噬細(xì)胞。

圖2 穩(wěn)定敲低NLRP3基因的巨噬細(xì)胞的篩選和鑒定Fig.2 Selection and identification of generated macropha-ges (RAWNKD) lacking NLRP3Note:A.GFP expression in transfected cells in the G418-contained medium;B.Observation for the GFP marker of the obtained RAWNKD cells；C.Definition of the GFP positive subset of G418-resistant cells.The gray histogram denotes the wild type macrophages,the green histogram indicates the G418-resistant macrophages,and the ‘Sorted GFP+ cells′ region defines the strong fluorescent cells,that is,the enriched subset (called RAWNKD)；D.RT-qPCR analysis for the NLRP3 mRNA level in the RAWNKD and RAW cells.RAW.A wild type macrophage line RAW264.7;RAWNKD.The generated line whose NLRP3 were stably knocked down;LPS.Lipopolysaccharide;ATP.Three adenosine monophosphate.

這些結(jié)果說明，RAWNKD細(xì)胞的NLRP3基因被穩(wěn)定敲低，缺少NLRP3基因會(huì)造成巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體缺損，RAWNKD細(xì)胞也可認(rèn)為是一種NLRP3炎性體缺損的巨噬細(xì)胞模型。

3 討論

NLRP3分子是包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的固有免疫細(xì)胞的一種重要胞內(nèi)模式識別受體(PRR)，與之相關(guān)的炎性體(NLRP3炎性體)在免疫反應(yīng)，特別是過度炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病的發(fā)生過程中，都有極其重要的作用[13-15]。NLRP3炎性體也因此成了近年來研究最多的炎癥小體。當(dāng)巨噬細(xì)胞受外源或內(nèi)源性刺激(PAMP或DAMP)而活化時(shí)，也伴隨著胞內(nèi)NLRP3分子及NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的白介素轉(zhuǎn)化酶(Caspase-1)的活化，致使巨噬細(xì)胞分泌大量IL-1β和IL-18等促炎性細(xì)胞因子，從而加重和放大局部的炎癥反應(yīng)[16]。巨噬細(xì)胞已成為NLRP3炎性體相關(guān)炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的常用免疫細(xì)胞模型。

本研究利用帶雙篩標(biāo)記(GFP熒光和Neomycin抗性)的shRNA表達(dá)載體介導(dǎo)的靶基因沉默及快速篩選策略，建立了帶GFP熒光標(biāo)記的NLRP3基因穩(wěn)定沉默的小鼠巨噬細(xì)胞模型(此處稱為RAWNKD巨噬細(xì)胞)[17-19]。在某種意義上，這種RAWNKD細(xì)胞也可認(rèn)為是一種NLRP3炎性體缺損的小鼠巨噬細(xì)胞模型(由于胞內(nèi)炎性體支架蛋白NLRP3分子的缺乏，巨噬細(xì)胞在活化時(shí)胞內(nèi)無法形成功能NLRP3炎性體)。此種類型的巨噬細(xì)胞模型，將為探究NLRP3炎癥小體在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，特別是NLRP3炎性體活化途徑及其介導(dǎo)的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)提供方便。

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