脯氨酰異構(gòu)酶1沉默抑制缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細胞凋亡①

郭紅雨 段永珂 何瑞利 程冠昌

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院心內(nèi)科，開封 475000)

心肌缺血是造成心臟病患者死亡的主要原因[1]，及時恢復(fù)心臟血液供應(yīng)是防治缺血損傷最有效的措施，然而缺血再灌注造成的心肌細胞損傷是亟待解決的問題[2]。細胞凋亡被認(rèn)為是心肌缺血再灌注損傷的重要病理基礎(chǔ)，細胞凋亡的數(shù)量決定了心肌缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度[3]。因此，闡明調(diào)控缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細胞凋亡的機制，對防治缺血再灌注損傷具有重要意義[4]。

肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶1(Peptidyl-prolyl cis/trans isomerase,NIMA-interacting 1，Pin1)參與多條信號通路的調(diào)控，在心血管疾病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[5]，此外，Pin1在心肌肥大和心臟衰老中也具有重要作用[6-8]。研究報道Pin1可誘導(dǎo)細胞凋亡[9-11]。然而，Pin1蛋白在缺氧復(fù)氧心肌細胞中的作用未見報道，因此本文以大鼠H9c2細胞為對象，研究Pin1對心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠胚胎H9c2心肌細胞系購自中國科學(xué)院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；TRIzol試劑盒和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；細胞凋亡檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Pin1抗體購自美國Cell Signaling公司；兔抗大鼠Bcl-2抗體、兔抗大鼠Bax抗體和兔抗大鼠GAPDH抗體購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；Pin1 siRNA(序列：TACGTCCAAGGTC-GGGCAGGAAGA)、scramble siRNA(序列：CAACCCGCTCCAAGGAATCG)均購于美國Invitrogen公司；Caspase-3活性檢測試劑盒購自南京建成有限公司；Pin1引物、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成，見表1。

1.2主要方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%融合時進行傳代。

1.2.2細胞分組及處理 將細胞分為空白對照組、缺氧/復(fù)氧(H/R)組、Pin1 siRNA組、scramble siRNA(scramble)組。空白對照組細胞在37℃、5%CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧組細胞在無血清無糖的DMEM培養(yǎng)基，95%N2和5%CO2培養(yǎng)3 h后，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2和95%空氣中培養(yǎng)1 h[12]；Pin1 siRNA組轉(zhuǎn)染Pin1 siRNA 24 h后進行缺氧/復(fù)氧處理；scramble組轉(zhuǎn)染非特異性siRNA后進行缺氧/復(fù)氧處理。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 將細胞接種于6孔板，待匯合率達90%，用LipofectamineTM2000將100 nmol/L Pin1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染24 h后進行缺氧/復(fù)氧處理。

表1引物序列

Tab.1Sequencesofprimers

NamePrimersequence(5′?3′)Product(bp)Pin1Forward：CCTAAAATGACTGGGAGGGGG125Reverse：TCCACTGCCCTTCTGAAGTCGAPDHForward：ACCACAGTCCATGCCATCAC419Reverse：TCCACCACCCTGTTGCTGTA

1.2.4MTT法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期的H9c2細胞接種于96孔板(3×104個/孔)，培養(yǎng)24 h后，每孔加20 μl MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)液體，加150 μl DMSO，搖床10 min充分溶解結(jié)晶物后，用酶標(biāo)儀檢測490 nm的光吸收值A(chǔ)。細胞存活率(%)=(各組A490值/空白對照組A490值)×100%。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)分析細胞凋亡率和壞死率 培養(yǎng)并收集各組細胞，用冰PBS清洗后，加入500 μl Binding Buffer調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml，分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光反應(yīng)10 min，進行流式細胞術(shù)檢測。

1.2.6Caspase-3活性的檢測 收集各組細胞，加入裂解液，冰浴裂解15 min，4℃、15 000 r/min離心5 min，10 μl，加入Ac-DEVD-pNA 10 μl，37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定405 nm的光吸收值A(chǔ)405。樣品的A405扣除空白對照的A405為樣品中Caspase-3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度。按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書，測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，對比計算出樣品中催化產(chǎn)生的pNA量計算Caspase-3活性。

1.2.7RT-qPCR實驗 用Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95℃變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.8Western blot檢測蛋白表達 裂解細胞后，用BCA法定量，取20 μg蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，放入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗大鼠Pin1抗體(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶200)、Bax抗體(1∶200)、Caspase-3抗體(1∶500)4℃過夜。漂洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶3 000)孵育2 h。TBST漂洗后用ECL顯色觀察。

2 結(jié)果

2.1Pin1在缺氧/復(fù)氧H9c2細胞中表達升高 由圖1所示，和空白對照組相比，缺氧/復(fù)氧H9c2細胞中Pin1的mRNA和蛋白表達顯著升高(PmRNA=0.000；P蛋白=0.003)。

2.2Pin1 siRNA轉(zhuǎn)染抑制Pin1表達 與對照組比，scramble siRNA組Pin1 mRNA和蛋白表達無顯著性差異(PmRNA=0.839；P蛋白=0.696)，Pin1 siRNA組Pin1的mRNA和蛋白表達顯著降低(均P=0.000)，見圖2。

圖1 Pin1 RT-qPCR和Western blot檢測Pin1的表達Fig.1 RT-qPCR and Western blot detection for Pin1 expression(±s,n=3)Note:A.Pin1 mRNA expression;B.Pin1 protein expression.*.P<0.05,vs control group.

圖2 Pin1 siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig.2 Pin1 siRNA transfection results (±s,n=3)Note:A.Pin1 mRNA expression;B.Pin1 protein expression.*.P<0.05 vs other groups.

圖3 Pin1 siRNA對細胞存活率的影響Fig.3 Effects of Pin1 siRNA on cell viability of H9c2 cells(±s，n=6)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

2.3Pin1 siRNA增加缺氧/復(fù)氧H9c2細胞存活率 MTT結(jié)果顯示，和對照組相比，缺氧/復(fù)氧組細胞的存活率顯著降低(P=0.000)；而Pin1 siRNA轉(zhuǎn)染后，缺氧/復(fù)氧H9c2細胞的存活率顯著增加(P=0.001)，見圖3。

2.4Pin1 siRNA對缺氧/復(fù)氧H9c2細胞凋亡和壞死的影響 實驗結(jié)果表明，和對照組相比，缺氧/復(fù)氧組細胞凋亡率顯著增多(P=0.000)，壞死率無顯著差異(P=0.103)；Pin1 siRNA組的細胞凋亡率明顯少于缺氧/復(fù)氧組(P=0.000)，壞死率無顯著差異(P=0.789)，見圖4。

圖4 流式細胞術(shù)檢測Pin1 siRNA對H9c2細胞凋亡率和壞死率的影響Fig.4 Effects of Pin1 siRNA on cell apoptotic rate (%) and necrotic rate (%) of H9c2 cells detected by flow cytometry(±s，n=3)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

圖5 Pin1 siRNA對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響n=3)Fig.5 Effects of Pin1 siRNA on protein expression of Bcl-2 and Bax(±s，n=3)Note:A.The protein expression of Bcl-2 and Bax；B.Comparison of Bcl-2/Bax.#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

圖6 Pin1 siRNA對Caspase-3活性影響Fig.6 Effects of siRNA on activity of Caspase-3(±s，n=6)Note:#.P<0.05 vs control group;*.P<0.05 vs H/R group.

2.5Pin1 siRNA對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達的變化，結(jié)果如圖5所示。和對照組相比，缺氧/復(fù)氧組細胞Bcl-2蛋白表達降低、Bax表達增高，Bcl-2/Bax降低(均P=0.000)。和缺氧/復(fù)氧組相比，Pin1 siRNA組Bcl-2表達升高，Bax表達減少，Bcl-2/Bax升高(均P=0.000)。

2.6Pin1 siRNA抑制Caspase-3活性的影響 和對照組相比，缺氧/復(fù)氧組細胞Caspase-3活性增加(均P=0.000)。和缺氧/復(fù)氧組相比，Pin1 siRNA組細胞Caspase-3活性顯著降低(均P=0.000)，見圖6。

3 討論

Pin1是一個進化上保守的肽基脯氨酰異構(gòu)酶，能夠特異性識別和結(jié)合特定的磷酸化蛋白，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而改變磷酸化蛋白質(zhì)的功能，影響細胞過程[13]。Pin1在調(diào)節(jié)心臟的病理生理過程中起著舉足輕重的作用[14]。研究表明，Pin1調(diào)控心肌肥厚信號[7]，可通過調(diào)節(jié)磷酸化分子的活性決定肥大心肌細胞的大小[6]。Pin1過表達可抑制心臟祖細胞衰老與死亡[8]，而抑制Pin1能夠減輕心肌纖維化和功能障礙[15]。本實驗通過心肌細胞缺氧/復(fù)氧模擬心臟缺血再灌注損傷，檢測Pin1對缺氧/復(fù)氧心肌細胞的作用。結(jié)果表明，Pin1在缺氧/復(fù)氧大鼠心肌細胞高表達，提示Pin1可能在心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷中發(fā)揮重要作用。為進一步探索Pin1對缺氧/復(fù)氧心肌細胞損傷的影響，我們用Pin1 siRNA沉默Pin1的表達，檢測了Pin1 siRNA對缺氧/復(fù)氧損傷心肌細胞的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pin1沉默能夠顯著增加缺氧/復(fù)氧H9c2細胞存活率，提示Pin1沉默可能對心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷有重要的保護作用。由于只用了一種siRNA，不能排除脫靶效應(yīng)，但是圖2 中Pin1 siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，和對照組及scramble siRNA組比較，Pin1表達下降了約75%，其功能性是可以保證的。

缺血再灌注可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡而使細胞死亡[16]。近年來，研究證實Pin1在調(diào)節(jié)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)Pin1可調(diào)節(jié)高劑量酒精誘導(dǎo)的小鼠心肌細胞凋亡。另據(jù)文獻報道Pin1沉默可抑制高氧誘導(dǎo)的A549細胞凋亡[17]。然而，Pin1是否參與缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡仍不明確，有待于進一步研究證實。本研究發(fā)現(xiàn)Pin1沉默能降低缺氧/復(fù)氧H9c2細胞凋亡率。Bax、Bcl-2和Caspase-3是線粒體凋亡信號通路中的下游分子[18]。Bcl-2家族是一種凋亡相關(guān)基因，通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[19]，其表達和調(diào)控是影響細胞凋亡的關(guān)鍵因素[20]。Bcl-2調(diào)節(jié)開啟線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔發(fā)揮抗凋亡作用，而Bax發(fā)揮促凋亡作用。Bcl-2/Bax的平衡影響凋亡的發(fā)生[21]。Caspase-3是Caspase依賴途徑中最終被主要激活的凋亡效應(yīng)酶，其活化在細胞凋亡的啟動過程中起著核心作用[22]，能夠水解多種重要的蛋白而導(dǎo)致細胞凋亡[23]。本試驗發(fā)現(xiàn)Pin1 siRNA能夠顯著上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax，增加Bcl-2/Bax比值，降低Caspase-3活性，抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

綜上，本研究在細胞水平證實，Pin1 siRNA可通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax，降低Caspase-3活性，抑制了缺氧/復(fù)氧造成的心肌細胞凋亡，為基因治療缺血性心臟病提供了新的思路。

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