京尼平苷對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響

王于林，葉 齊，徐之良*

(1．武漢大學(xué)人民醫(yī)院兒科，武漢 430060；2．福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002)

糖尿病是一種危害性較大的常見(jiàn)疾病，是由多種病因引起的代謝異常癥[1]。糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛是糖尿病的一種常見(jiàn)且重要的并發(fā)癥[2]，由于其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，臨床常用藥物如抗抑郁、抗癲癇、離子通道阻斷藥等均不能令人滿意[3]。因此，研究新的作用機(jī)制、尋找新的藥物是目前的研究熱點(diǎn)。

京尼平苷(geniposide，GP)是梔子的主要成分之一，屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，京尼平苷具有抗炎、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗阿爾茲海默癥、抗糖尿病及神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[5]。本研究采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病性模型，觀察京尼平苷對(duì)糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 ONE-TOUCH 血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)；Eclipse 80i 熒光正置顯微鏡(日本Nikon公司)；2390 型Von Frey測(cè)痛儀(美國(guó)IITC公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek Instruments公司)。

1.2試藥 京尼平苷(GE，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，批號(hào)140815，南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司)；熒光抗衰減封片液(中國(guó)碧云天公司)；TritonX-100(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；OCT(optimal cutting temperature compound) 包埋液(美國(guó)櫻花公司)；Anti-IbaI antibody(批號(hào)ab178847)，英國(guó)Abcam公司，1∶500稀釋；Alexa Fluor 594驢抗兔二抗，美國(guó)Jackson Immuno Research公司，1∶400稀釋；TNF-α和IL-1βELISA試劑盒，美國(guó)Abcam公司。

1.3動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002)。恒溫恒濕環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水飲食。

2 方法

2.1鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型的建立、分組及給藥 將鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)溶于檸檬酸緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度為10 g·L-1的溶液。大鼠禁食不禁水12 h后，按照60 mg·kg-1腹腔注射。建模后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行篩選，血糖大于16.7 mmol·L-1為建模成功，小于16.7 mmol·L-1的動(dòng)物退出實(shí)驗(yàn)。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和京尼平苷1，10和100 mg·kg-1劑量組，在建模后第21天給予對(duì)應(yīng)藥物或配藥液，每日1次，連續(xù)給藥7 d。

2.2機(jī)械痛覺(jué)測(cè)試 測(cè)試前，將大鼠放入底部為鐵絲網(wǎng)的透明有機(jī)玻璃觀察盒中適應(yīng)30 min，用標(biāo)準(zhǔn)化的Von Frey 纖維絲從低到高的力度測(cè)試大鼠足部痛閾值。大鼠出現(xiàn)縮足或舐足反應(yīng)時(shí)的刺激強(qiáng)度被定義為大鼠的機(jī)械痛閾值。實(shí)驗(yàn)平行測(cè)試3 組，間隔30 min，所得平均值為大鼠機(jī)械痛閾值。

2.3熒光免疫組織化學(xué) 各組動(dòng)物給藥及測(cè)試結(jié)束后，腹腔注射質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛麻醉，用0.01 mol·L-1的PBS緩沖液經(jīng)主動(dòng)脈沖洗血液至肝臟變白，繼而用質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛PBS緩沖液灌注，灌注完畢后立刻取大鼠脊髓L4-L6段，置于該灌流液中繼續(xù)固定24 h，移至含質(zhì)量濃度為300 g·L-1蔗糖的PB溶液中脫水48 h，直至組織塊沉于容器底部。組織塊用OCT(optimal cutting temperature compound) 包埋后置于冰凍切片機(jī)上制作25 μm的切片，切片經(jīng)PBS緩沖液漂洗后，用含體積分?jǐn)?shù)為10%驢血清的PBS緩沖液封閉1 h，加入脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體Iba-1 100 μL，4 ℃孵育過(guò)夜。繼而將切片用PBS緩沖液漂洗后，加入驢抗兔二抗37 ℃孵育1 h，PBS緩沖液漂洗后避光、封片，熒光顯微鏡拍照。

2.4ELISA測(cè)試 按照2.3項(xiàng)下方法，各組大鼠麻醉灌注后直接取脊髓L4-L6段，置于含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液中，將組織勻漿裂解，裂解液在4 ℃下，以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)TNF-α及IL-1βELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1京尼平苷對(duì)STZ大鼠血糖值及體質(zhì)量的影響 大鼠在注射STZ后表現(xiàn)為多飲、多食和毛色枯黃等現(xiàn)象。與對(duì)照組比較，STZ注射后第7天，大鼠血糖值顯著升高，并持續(xù)到觀察期第28天(P<0.01)。京尼平苷高、中劑量組均可一定程度降低血糖(P<0.05)。對(duì)照組大鼠體質(zhì)量隨著時(shí)間平穩(wěn)增加(P<0.05)，模型組大鼠體質(zhì)量基本不變(P>0.01)；與模型組比較，京尼平苷對(duì)大鼠體質(zhì)量影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1京尼平苷對(duì)糖尿病大鼠血糖和體質(zhì)量的影響

A.對(duì)血糖的影響；B.對(duì)體質(zhì)量的影響。

注：與對(duì)照組比較***P<0.01;與模型組比較#P<0.05，

##P<0.01。

Fig.1 Effects of geniposide on blood glucose and body weight in diabetic rats

A.the effects of blood glucose；B.the effects of body weight.

Note:***P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group.

3.2京尼平苷對(duì)STZ大鼠機(jī)械痛閾值的影響 在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠模型上，觀察京尼平苷的抗神經(jīng)病理性疼痛作用。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(加巴噴丁40 mg·kg-1)、京尼平苷低劑量組(1 mg·kg-1)、京尼平苷中劑量組(10 mg·kg-1)和京尼平苷高劑量組(100 mg·kg-1)，每組8只。建模第21天開(kāi)始對(duì)應(yīng)給藥，連續(xù)給藥7 d，每日1次，測(cè)定機(jī)械痛閾值。與對(duì)照組比較，建模7 d后模型組大鼠痛閾值顯著降低(P<0.01)，并持續(xù)到觀察期第28天，提示成功建立1型糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛模型。給予陽(yáng)性對(duì)照組加巴噴丁后，痛閾值逐步上升；給予高劑量組京尼平苷后，痛閾值逐步上升，從第22天起與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量組也可一定程度提高痛閾值，于第25天后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示京尼平苷具有治療STZ誘導(dǎo)糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛大鼠機(jī)械痛敏的作用。見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較**P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01。

Note:**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group.

3.3京尼平苷對(duì)STZ大鼠脊髓L4-L6段脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響 待上述行為學(xué)測(cè)試完畢后，立刻處死大鼠取脊髓L4-L6段進(jìn)行熒光免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞較為均勻地分布于脊髓背角，數(shù)量較少，熒光強(qiáng)度較低。模型組脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量呈爆發(fā)式增加，胞體呈圓形，突起消失，呈“阿米巴樣”，熒光強(qiáng)度變高，呈活化態(tài)。給予京尼平苷后，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，熒光強(qiáng)度降低。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及京尼平苷高、中劑量組可顯著抑制脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活化。見(jiàn)圖3。

3.4京尼平苷對(duì)STZ大鼠脊髓L4-L6段TNF-α和IL-1β水平的影響 通過(guò)ELISA法測(cè)定各組大鼠脊髓L4-L6節(jié)段致炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠脊髓背角IL-1β和TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組顯著抑制IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平(P<0.05)；京尼平苷高劑量組可顯著降低STZ大鼠脊髓背角IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平(P<0.01)；京尼平苷中劑量組也可一定程度降低IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平(P<0.05)；京尼平苷低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.京尼平苷 1 mg·kg-1組；D.京尼平苷 10 mg·kg-1組；E.京尼平苷 100 mg·kg-1組；F.陽(yáng)性對(duì)照組；G.各組熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。與對(duì)照組比較***P<0.001；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01。

A.control group；B.model group；C.geniposide 1 mg·kg-1group；D.geniposide 10 mg·kg-1group；E.geniposide 100 mg·kg-1group；F.positive control group；G.statistical chart of the fluorescence intensity.***P<0.001 vs control group；#P<0.05，

##P<0.01 vs model group.

圖4京尼平苷對(duì)糖尿病大鼠脊髓背角致炎細(xì)胞因子的影響

A.對(duì)糖尿病大鼠脊髓背角IL-1β的影響；B.對(duì)糖尿病大鼠脊髓背角TNF-α的影響。與對(duì)照組比較##P<0.01；與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

Fig.4 Effects of geniposide on the production of cytokines in rat lumbar spinal cord of diabete rats

A.effects of geniposide on the production of IL-1β；B.effects of geniposide on the production of TNF-α.##P<0.01 vs control group；*P<0.05，**P<0.01 vs model group.

4 討論

糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛是糖尿病較常見(jiàn)的一種并發(fā)癥，屬于慢性神經(jīng)病理性疼痛，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，缺乏有效的治療藥物和手段[6]。

京尼平苷為環(huán)烯醚萜苷類成分，文獻(xiàn)報(bào)道其具有擬膽囊收縮素樣作用，可以治療2型糖尿病[7]，還具有降血糖、改善血管病變、抗炎和抗氧化應(yīng)激等作用[8]，提示其可能具有較好的抗糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠觀察到京尼平苷可顯著降低大鼠的機(jī)械痛閾值、降低血糖水平、抑制脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活化及致炎細(xì)胞因子水平。

近年研究表明，糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛與脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)[9]。脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞屬于神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，其數(shù)量占膠質(zhì)細(xì)胞的10%～15%[10]。生理狀態(tài)下，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。受環(huán)境影響，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞可根據(jù)其所處微環(huán)境迅速做出反應(yīng)，產(chǎn)生不同的表型，分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，呈現(xiàn)活化態(tài)[11]。細(xì)胞形態(tài)上，活化的脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞常表現(xiàn)為突起回縮，胞體相對(duì)增大乃至呈巨噬細(xì)胞樣[12]?；罨募顾璞辰切∧z質(zhì)細(xì)胞不僅表現(xiàn)為形態(tài)變化，同時(shí)能夠迅速增殖、遷移和釋放活性氧物質(zhì)，爆發(fā)性分泌大量神經(jīng)毒素和炎癥介質(zhì)，如細(xì)胞毒性物質(zhì)如一氧化氮、氧自由基和炎性因子(如IL-1β、TNF-α和IFN-γ)等[13]。TNF-α作為一種致炎細(xì)胞因子，在疼痛通路中起著重要的作用，可通過(guò)TNF受體(TNFRs)，傳遞信號(hào)使神經(jīng)元異位放電并產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏，也可激活核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor kappa B，NF-κB)，促進(jìn)致炎細(xì)胞因子的合成，參與傳遞調(diào)控痛覺(jué)信號(hào)[14]。IL-1β也是與疼痛關(guān)系密切的一種致炎細(xì)胞因子，可增強(qiáng)興奮性突觸傳遞和/或降低抑制性突觸傳遞增強(qiáng)痛覺(jué)傳遞[15-16]。實(shí)驗(yàn)觀察到，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病模型上，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)上出現(xiàn)阿米巴樣的活化形態(tài)，且數(shù)量顯著增加，這與先前文獻(xiàn)報(bào)道一致。京尼平苷可顯著抑制脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，同時(shí)也可降低與疼痛關(guān)系密切的致炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α水平，提示京尼平苷抗糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛可能與其抑制脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)還觀察到，京尼平苷可降低糖尿病大鼠的血糖水平。高血糖是誘發(fā)糖尿病痛覺(jué)過(guò)敏、神經(jīng)病變的重要因素之一[17]。大量文獻(xiàn)證實(shí)，高血糖能夠誘導(dǎo)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并釋放大量如IL-6、IL-1β和TNF-α等致炎細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)炎炎癥及慢性疼痛的發(fā)生[18-19]。高血糖可能通過(guò)引起代謝和酶變以及產(chǎn)生丙二醛、脂質(zhì)過(guò)氧化、羰基化蛋白、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶，使脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特性發(fā)生改變[20]。因此，京尼平苷降血糖的作用可能與其抑制脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活化有一定的聯(lián)系。

綜上所述，京尼平苷具有一定的抗糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活化和降低致炎細(xì)胞因子水平發(fā)揮作用，也可能與其降血糖有關(guān)，但具體作用靶點(diǎn)及途徑還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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