人參三七茶抗疲勞及免疫調(diào)節(jié)作用研究

王海桃,朱 娜,李海僖，王 帥*

(1.青島市腫瘤醫(yī)院，青島 266042；2.青島市中心醫(yī)院，青島 266042)

人參和三七均為五加科植物，均為我國傳統(tǒng)名貴中藥材。人參含有人參皂苷、人參多糖、人參多肽及揮發(fā)油、多種氨基酸、脂肪酸、維生素和微量元素等有效成分,具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血和安神益智[1]等功效?，F(xiàn)代藥理學研究認為，人參具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]。三七的主要成分為三七總皂苷、三七素、糖類及各種微量元素等，具有活血化瘀、消腫止痛、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[4]。但人參與三七聯(lián)合用于抗疲勞及增強免疫方面的茶飲研究未見報道，本文用人參三七茶對小鼠進行實驗，旨在觀察其在抗疲勞及免疫調(diào)節(jié)方面的作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 全自動酶標儀(RT6000)，購自美國雷度公司。

1.2試藥 RPMI-1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽、臺盼藍和ConA，均購自Sigma公司；尿素氮試劑盒(批號20161012)、肝糖原試劑盒(批號20061125)，均購自南京建成生物制品有限公司。

1.3動物 昆明種小鼠(清潔級), 體質(zhì)量18～22 g, 雌雄各半, 由青島市藥品檢驗所實驗動物中心提供[合格證號SCXLKL(魯)20140007]。小鼠分性別飼養(yǎng)于空調(diào)實驗室內(nèi)，室溫為22±2 ℃，相對濕度為60%±2%。

2 方法

2.1人參三七茶的制備 按照文獻方法[5]進行。

2.2小鼠負荷游泳實驗 取小鼠40只,隨機分為空白對照組(生理鹽水)、人參三七茶高劑量組(人參、三七劑量均為0.8 g·kg-1)、人參三七茶中劑量組(人參、三七劑量均為0.4 g·kg-1)、人參三七茶低劑量組(人參、三七劑量均為0.2 g·kg-1)，每組10只。分別按照小鼠體質(zhì)量0.01 mL·g-1的劑量連續(xù)灌胃40 d。末次灌胃30 min后,鼠尾根部負荷5%體質(zhì)量的鉛皮,將小鼠放入水中游泳,水深30 cm，水溫25±0.05 ℃，記錄小鼠自游泳開始至游泳力竭(沉入水面下6 s不能上浮)的時間，即小鼠力竭游泳時間[6]。

2.3血清尿素氮和肝糖原的含量測定 取小鼠40只, 分組同2.2，分別按照小鼠體質(zhì)量0.01 mL·g-1的劑量連續(xù)灌胃40 d。末次灌胃30 min后,將小鼠放入30 ℃水中負荷游泳90 min，休息60 min后立即摘眼球采血,測定血液中尿素氮的含量。取血后立即處死，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干,精確稱取肝臟100 mg, 勻漿器研磨、離心，加預(yù)冷的生理鹽水制備成質(zhì)量濃度為100 g·L-1的組織勻漿。2～4 ℃冷凍離心，分離上清液，用肝糖原試劑盒測定肝糖原的含量[7]。

2.4脾淋巴細胞懸液的制備 在實驗的第40天，將各組小鼠在眼球采血后處死，用體積分數(shù)為75%的乙醇浸泡5 min進行消毒，在無菌條件下取小鼠脾臟，取RPMI-1640 培養(yǎng)基5 mL，用注射器緩慢注入脾內(nèi)沖出細胞，連續(xù)沖洗2次，直到脾被膜透明為止。收集脾細胞液，以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加Tris-NH4Cl 3 mL，混勻，放置5 min，棄紅細胞，重復(fù)2次。細胞沉淀用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，再用上述同樣方法離心去上清液，重復(fù)2次，細胞用Trypan Blue染色，計數(shù)活細胞為95%以上，用RPMI-1640 培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整為5×109個·L-1。取96孔板，將空白對照組和人參三七茶高、中、低劑量各組的脾淋巴細胞分別進行接種，每只小鼠設(shè)2個復(fù)孔，每孔加入100 μL脾淋巴細胞懸液。用MTT法在570 nm處測定吸光度值A(chǔ)，計算以刺激指數(shù)(SI)表示，SI=藥物刺激孔吸光度值/對照孔吸光度值[8]。

2.5對小鼠NK細胞活性的影響 將脾淋巴細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，使其達到5×109個·L-1，在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取處于對數(shù)生長期的人肺癌細胞，制成2×108個·L-1的靶細胞懸液。調(diào)整效應(yīng)細胞與靶細胞的比例為50∶1；其中，效應(yīng)細胞對照孔加入效應(yīng)細胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細胞對照孔加入靶細胞和培養(yǎng)液各100 μL，實驗孔加入效應(yīng)細胞和靶細胞各100 μL，每個標本做2個復(fù)孔。在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，操作同前，加入MTT，在570 nm處測定吸光度值A(chǔ)，結(jié)果以NK細胞活性表示：NK細胞活性=[1-(實驗孔(效應(yīng)細胞+靶細胞)-效應(yīng)細胞對照孔)∕靶細胞對照孔]×100%[9]。

3 結(jié)果

3.1對小鼠抗疲勞能力的影響 與空白對照組比較，給予低劑量人參三七茶的小鼠，其游泳耗竭時間沒有明顯提高，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；給予中、高劑量的人參三七茶能夠明顯延長小鼠的游泳耗竭時間(P<0.01)；與空白對照組比較，給予中、低劑量人參三七茶的小鼠，其血清尿素氮及肝糖原含量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；給予高劑量人參三七茶的小鼠能明顯降低尿素氮含量并提高肝糖原的含量，與對照組比較，差異均有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1人參三七茶對小鼠抗疲勞能力的影響

Tab.1 Influence of Ginseng and Sanchi Tea on anti-fatigue in mice

(n=10，±s)

注：與空白對照組比較*P<0.01。

3.2對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響 給予低、中劑量人參三七茶的小鼠其SI值分別為1.027±0.009和1.045±0.019，與空白對照組(1.028±0.013)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而給予高劑量人參三七茶組小鼠的SI值(1.193±0.024)和對照組比較差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且高劑量組的SI值與低、中劑量組的SI值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.3人參三七茶對小鼠NK細胞活性的影響 給予低、中劑量人參三七茶組小鼠的NK細胞活性分別為0.746%±0.041%和0.773%±0.018%，與空白對照組(0.748%±0.022%)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給予高劑量人參三七茶組小鼠的NK細胞活性為0.904%±0.035%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

4 討論

在長時間耐力運動時，體內(nèi)糖貯備和肝糖原耗竭是疲勞的原因。糖類是主要的能量物質(zhì)，其供應(yīng)不足時會通過蛋白質(zhì)分解供能，進而產(chǎn)生大量尿素氮釋放到血液中[10]。尿素氮含量是糖類供能充足與否的衡量標準，其清除效率與運動產(chǎn)生的肌肉疲勞效應(yīng)呈負相關(guān)。肝糖原的儲備量可直接影響機體體能和運動性疲勞出現(xiàn)的快慢或程度[11]。提高肝糖原的儲備量或減少其消耗有助于提高機體耐力和運動能力，有利于抵抗疲勞[12]。

研究結(jié)果顯示,人參三七茶的高、中劑量組能夠明顯延遲小鼠力竭狀態(tài)的出現(xiàn),高劑量的人參三七茶能夠顯著降低尿素氮含量并提高肝糖原的含量。結(jié)果表明，使用人參三七茶后，小鼠的抗運動疲勞能力增強,人參三七茶可通過增加肝糖原儲存以提供運動所需的能量，降低因運動疲勞造成尿素氮在體內(nèi)的蓄積、提高運動能力,從而延長小鼠游泳耗竭時間[13-14]。

淋巴細胞轉(zhuǎn)化是淋巴細胞受到抗原的刺激或有絲分裂增殖時的細胞活化，該細胞可轉(zhuǎn)化為母細胞。淋巴細胞的分裂增殖能力在一定程度上反映了機體細胞免疫功能的強弱[15]，且轉(zhuǎn)化率的高低可反映出機體的細胞免疫水平,當淋巴細胞增殖能力增強時，細胞受刺激引起活化，免疫力增強[16-17]，反之，則說明免疫水平低。因此，淋巴細胞可間接檢測機體免疫能力的高低，故常作為實驗室檢測指標[18]。實驗研究表明，人參三七茶高劑量組的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化明顯高于空白對照組，且差異顯著，說明使用高劑量的人參三七茶可使小鼠的淋巴細胞轉(zhuǎn)化增強，增強免疫力。

NK細胞在機體中參與抗病毒、病原微生物和腫瘤的免疫，是機體先天性免疫的第一道天然防線[19]，主要存在于外周血和脾臟中，不依賴抗體也不需要抗原刺激和致敏就能殺傷靶細胞[20]。研究結(jié)果表明，高劑量人參三七茶能夠明顯提高小鼠的NK細胞活性，提高小鼠免疫力。

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