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    蛇床子總香豆素對心肌梗死大鼠線粒體形態(tài)的影響

    2018-03-22 08:52:23孟慶華劉靖麗
    西北藥學雜志 2018年2期
    關鍵詞:蛇床子香豆素線粒體

    權(quán) 彥,孟慶華,劉靖麗

    (陜西中醫(yī)藥大學藥學院,咸陽 712046)

    心肌梗死發(fā)病率高,死亡率高,嚴重危害人類健康[1]。實驗發(fā)現(xiàn),心肌梗死大鼠細胞線粒體大小不一,出現(xiàn)線粒體形態(tài)學損傷,進而導致線粒體功能損傷,出現(xiàn)心肌功能障礙[2]。因此,通過恢復線粒體分裂與融合之間的平衡,并使其能夠在心肌細胞中正常工作成為保護心肌的重要策略[3-4]。研究表明,從傘形科蛇床屬植物蛇床(Cnidiummonnieri(L.)Cuss)的干燥果實蛇床子中提取出來的總香豆素具有抗心律失常和抗高血壓等心血管保護作用,但其具體機制尚不清楚[5]。本實驗以心肌梗死大鼠為模型,旨在探討蛇床子總香豆素對心肌梗死大鼠心肌的作用及其以線粒體為靶點的保護機制。

    1 儀器與材料

    1.1儀器 ML866型Power Lab生物記錄系統(tǒng)(埃德儀器國際貿(mào)易有限公司);H-7650型透射電子顯微鏡(株式會社日立制造所);TE2000-U型倒置顯微鏡(日本尼康株式會社);電泳儀和電泳槽(上海培清科技有限公司);TE22型濕電轉(zhuǎn)膜儀(美國Hoefer公司)。

    1.2試藥 蛇床子總香豆素(西安綠泉生物科技有限公司);肝素鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司);Drp1抗體(美國Cell Signaling Technology公司);OPA1抗體(美國Santa Cruz圣克魯斯公司);GAPDH抗體(美國Fermentas公司);山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG(北京天德悅生物科技有限責任公司)。

    1.3動物 SPF級SD雄性大鼠40只,體質(zhì)量200~230 g,由西安交通大學實驗動物中心提供。

    2 方法

    2.1動物造模 取3 g戊巴比妥鈉溶于100 mL生理鹽水中,配制成質(zhì)量濃度為30 g·L-1的戊巴比妥鈉溶液。以40 mg·kg-1的劑量將SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉,在左胸中部第4和5肋之間切開皮膚,用止血鉗鈍性撐開胸腔,暴露心臟,于左冠脈前降支距左心耳緣下緣2 mm處穿線結(jié)扎,當觀察到結(jié)扎線以下心肌顏色變暗、心電圖ST段明顯抬高即為造模成功[6]。結(jié)扎完畢將大鼠心臟放回胸腔,排氣,縫合,消毒,腹腔注射青霉素(5×104U·只-1),共3 d。

    2.2實驗分組及給藥 造模成功大鼠經(jīng)1周恢復后分為模型組和香豆素組,每組12只。香豆素組大鼠以每日20 mg·kg-1灌胃給予蛇床子總香豆素[7];模型組給予相同體積的生理鹽水,共8周。假手術(shù)組大鼠開胸后在冠狀動脈下穿線不結(jié)扎,其他操作同模型組。

    2.3血流動力學檢測 8周后,各組大鼠腹腔注射40 mg·kg-1戊巴比妥鈉溶液麻醉,將PE-50管填充肝素鈉經(jīng)大鼠頸總動脈插管入左心室,導管另一端接Power Lab多功能壓力傳感器,待穩(wěn)定后,監(jiān)測記錄大鼠心率(heart rate,HR)、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)以及左室內(nèi)壓上升段/下降段做大變化速率(the maximal rate of rise and decline of ventricular pressure respectively,±dP/dt)。

    2.4蘇木素-伊紅(H-E)染色 取大鼠心臟,預冷,用PBS緩沖液沖洗干凈,采用體積分數(shù)為15%的甲醛固定,脫水、透明、石蠟包埋、切片進行H-E染色,在光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌壞死和膠原纖維沉積狀況。

    2.5透射電鏡觀察心肌線粒體結(jié)構(gòu) 將大鼠心尖組織切成1 mm3方塊后置于25 mL·L-1戊二醛中,在4 ℃進行2 h前固定。用0.1 mol·L-1PBS緩沖液沖洗,置于質(zhì)量濃度為10 g·L-1的四氧化鋨中4 ℃進行2 h后固定,用梯度乙醇洗脫,環(huán)氧丙烷置換,最后用環(huán)氧樹脂進行包埋,并切成半超薄切片進行醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染,在透射電鏡下觀察心肌線粒體的形態(tài)變化。

    2.6Western Blot 取大鼠心尖組織,按照蛋白提取試劑盒說明書在冰上充分裂解組織蛋白,離心后采用十二烷基磺酸鈉溶液將蛋白溶解,BCA法檢測蛋白濃度。以每孔30 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,移至PVDF膜1.5 h,用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h,4 ℃視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy-1,OPA1)和動力相關蛋白1(dynamin-related peptide 1,Drp1)一抗孵育過夜,組織總蛋白以GAPDH為內(nèi)參,洗滌,室溫孵育二抗40 min;再次洗滌后,增強化學發(fā)光。

    3 結(jié)果

    3.1蛇床子總香豆素對大鼠心臟結(jié)構(gòu)的影響 為證實香豆素對心肌梗死后大鼠心臟具有保護作用,采用H-E染色對左心室組織進行形態(tài)學觀察,見圖1。由圖1可知,假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊緊密;結(jié)構(gòu)豐滿,邊界清晰。模型組心肌結(jié)構(gòu)遭到破壞且有瘢痕形成;細胞核聚集,心肌纖維腫脹、溶解或斷裂。香豆素組可有效減輕心肌結(jié)構(gòu)損傷,減少心肌纖維斷裂,縮小瘢痕面積及降低纖維化。

    圖1蛇床子總香豆素對左心室結(jié)構(gòu)的影響

    A.假手術(shù)組;B.模型組;C.香豆素組。

    Fig.1 The effect of coumarines from the fruits ofCnidiummonnierion left ventricular structure in rat myocardial infarction model

    A.sham operation group;B.model group;C.coumarines group.

    3.2蛇床子總香豆素對大鼠心功能的影響 見表1。由表1可知,各組大鼠心率無顯著性變化。與假手術(shù)組相比,模型組心梗大鼠MAP、LVSP、+dP/dt和-dP/dt降低,LVEDP升高;而蛇床子總香豆素干預后顯著逆轉(zhuǎn)了這些指數(shù)的變化,說明蛇床子總香豆素能夠減輕大鼠心肌梗死損傷。

    表1香豆素對心肌梗死大鼠心功能的影響

    Tab.1 The effect of coumarines on cardiac function in rat model of myocardial infarction

    項目假手術(shù)組模型組香豆素組HR/次·min-1208±21298±24302±14MAP/mmHg102.3±7.976.5±12.1*90.1±5.2#LVSP/mmHg140.4±6.8103.3±7.1*121.5±9.6#LVEDP/mmHg3.87±0.227.48±0.31*5.32±0.19#+dP/dtmax/mmHg·s-16254±1743524±151*5273±167#-dP/dtmax/mmHg·s-14966±1252419±147*3246±131#

    注:與假手術(shù)組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05。

    3.3蛇床子總香豆素對心肌線粒體形態(tài)的影響 線粒體損傷是導致心肌梗死大鼠心臟功能障礙的重要因素,推測蛇床子總香豆素對心臟的保護作用可能與降低線粒體損傷相關。故采用透射電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)和在心肌排列中的變化,見圖2。由圖2可知,假手術(shù)組大鼠心肌線粒體排列整齊,結(jié)構(gòu)完整,大小均一;模型組心肌線粒體碎片增多,膜結(jié)構(gòu)溶解,出現(xiàn)空泡;香豆素組線粒體結(jié)構(gòu)得到明顯改善。

    3.4蛇床子總香豆素對心肌線粒體形態(tài)學相關蛋白的影響 線粒體形態(tài)主要通過調(diào)節(jié)線粒體融合蛋白OPA1和線粒體分裂蛋白Drp1實現(xiàn),推測蛇床子總香豆素改善線粒體形態(tài)可能與OPA1和Drp1的表達改變相關,見圖3。由圖3可知,與假手術(shù)組相比,模型組心臟OPA1表達降低,見圖3A,Drp1表達升高,見圖3B,而蛇床子總香豆素顯著上調(diào)OPA1,下調(diào)Drp1,說明蛇床子總香豆素可改善心肌梗死大鼠的線粒體形態(tài)。

    圖2蛇床子總香豆素對心肌線粒體排列和結(jié)構(gòu)的影響

    A.假手術(shù)組;B.模型組;C.香豆素組;M.線粒體。

    Fig.2 The effect of coumarines from the fruits ofCnidiummonnierion cardiac mitochondrial arrangement and structure

    A.sham operation group;B.model group;C.coumarines group;M.mitochondria.

    圖3蛇床子總香豆素對心肌梗死大鼠心肌線粒體形態(tài)學相關蛋白表達的影響

    A.線粒體融合蛋白OPA1;B.線粒體分裂蛋白Drp1。

    Fig.3 The effect of coumarines from the fruits ofCnidiummonnierion the protein expression of cardiac mitochondrial morphology in rat myocardial infarction model

    A.OPA1,a mitochondrial fusion protein;B.Drp1,a mitochondrial fission protein

    4 討論

    心肌梗死是臨床常見的威脅人類生命健康的心血管疾病,主要是由于冠狀動脈供血不足引起的心肌缺血、缺氧及心肌壞死[8]。臨床上現(xiàn)有的溶栓或介入治療雖然提高了患者的生存率,但對心血管缺血損傷的防治有限[9]。蛇床子總香豆素是從中藥蛇床子中分離得到的一種香豆素類化合物,是蛇床子的重要活性成分[10]?,F(xiàn)代藥理學研究顯示,香豆素類化合物具有抗心律失常、抗心肌肥厚和抗高血壓等心血管保護作用[2,11]。本研究通過結(jié)扎大鼠冠脈左前降支模擬心肌梗死,通過給予蛇床子總香豆素20 mg·kg-1,持續(xù)8周,結(jié)果顯示,蛇床子總香豆素可改善大鼠心肌纖維化,減少心肌梗死面積,進而提高心肌梗死大鼠MAP(25.6%)、LVSP(17.6%)和+dP/dt和-dP/dt(分別為49.6%和34.2%)以及降低LVEDP(28.9%),改善大鼠心臟功能。

    線粒體是一種高度動態(tài)結(jié)構(gòu)的細胞器,其形態(tài)不斷發(fā)生融合與分裂[12]。該過程對維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)態(tài)至關重要。線粒體融合促進ATP分配,加速線粒體之間mtDNA和相關內(nèi)容物的交流,抵抗線粒體衰老[13];線粒體通過分裂去除損傷部分,維持線粒體群體的健康,是保持線粒體數(shù)量和質(zhì)量的主要基礎[14],而Drp1和OPA1分別是介導線粒體分裂和融合過程中不可或缺的蛋白因子。因此,Drp1和OPA1的表達失衡將導致線粒體分裂和融合失衡,直接損傷線粒體氧化磷酸酸化,導致心肌細胞能量代謝障礙[15-16]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠的心肌線粒體碎片增多,線粒體腫脹,出現(xiàn)大量空泡化,且OPA1表達降低,Drp1增加,說明心肌梗死大鼠線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷,線粒體遭破壞,該結(jié)果與Disatnik M H等[17]在心肌缺血再灌注大鼠模型中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn),一些中藥能夠通過調(diào)節(jié)線粒體功能而抵抗心血管損傷[18-19]。實驗發(fā)現(xiàn),給予蛇床子總香豆素后,大鼠心肌組織線粒體形態(tài)接近于假手術(shù)組,表現(xiàn)為線粒體形態(tài)大小均一,無明顯腫脹,且蛇床子總香豆素能上調(diào)OPA1,下調(diào)Drp1,表明蛇床子總香豆素可改善心肌梗死大鼠線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu),維持線粒體分裂和融合的動態(tài)平衡,從而提高心肌梗死大鼠心臟功能。

    實驗結(jié)果表明,蛇床子總香豆素可明顯減少心肌梗死面積,改善心肌梗死大鼠心臟功能,減少梗死心肌線粒體碎片、腫脹和空泡化,改善線粒體形態(tài)學相關蛋白OPA1和Drp1的表達。綜上所述,蛇床子總香豆素可改善心肌梗死大鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能,其機制可能與改善線粒體形態(tài)有關。

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