微生物教學(xué)中噬菌蛭弧菌的最佳保藏方法探究

于 穎，牟星禹，陸 萌，羅 瑤，劉詩堯，楊玉婷，汪 紅，樊 佳

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065)

20世紀(jì)60年代，Stolp和Petiold首次分離得到了蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)[1]。它廣泛分布于自然水域、污水和土壤中，是一類專門以捕食細(xì)菌為生的寄生性細(xì)菌，可以有效裂解水體中的一些病原菌[2-3]，同時(shí)還可以緩解水體中一些有害物質(zhì)的影響[4]，并且對(duì)魚類致病菌有明顯的裂解作用[5-7]，因此可利用該特性來防止水產(chǎn)動(dòng)物的病害，其微生物生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也發(fā)揮了較大的作用[8-9]。

噬菌蛭弧菌是一類可以寄生于其他細(xì)菌并使其裂解的革蘭氏陰性細(xì)菌，因此，在半固體和固體介質(zhì)中蛭弧菌侵噬宿主菌后會(huì)形成類似于病毒感染細(xì)胞后形成的空斑。利用這一特性，在教學(xué)中已成功開設(shè)了蛭弧菌菌斑觀察實(shí)驗(yàn)[10]及蛭弧菌對(duì)污水凈化實(shí)驗(yàn)[11]。通過上述實(shí)驗(yàn)，學(xué)生可以更加直觀地了解到蛭弧菌特有的生物學(xué)特性。為了進(jìn)一步探究蛭弧菌“活抗生素”的可行性，并使學(xué)生進(jìn)一步了解蛭弧菌的特性，菌種保藏方法就顯得極為重要。通常實(shí)驗(yàn)室采取4℃平板保藏法來保藏菌種[12]，該方法不但操作簡(jiǎn)單，且復(fù)活率達(dá)到100%，但是這種方法一般只能保藏4個(gè)月左右，4個(gè)月后培養(yǎng)基就會(huì)嚴(yán)重脫水變干，需要不斷活化轉(zhuǎn)種來保持它的生物學(xué)活性。因此該方法耗時(shí)繁瑣不適合長(zhǎng)期保存。為了方便實(shí)驗(yàn)教學(xué)，找到一種既可以延長(zhǎng)蛭弧菌保藏時(shí)間又較為簡(jiǎn)便的方法尤為重要。而關(guān)于蛭弧菌的保藏方法，國內(nèi)外的研究比較少，且各實(shí)驗(yàn)室報(bào)道結(jié)果各異。1963年文獻(xiàn)[13]提出了在含有宿主細(xì)胞的YP瓊脂中保藏蛭弧菌，每月轉(zhuǎn)種一次的培養(yǎng)方法。2002年文獻(xiàn)[12]為了探究蛭弧菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的作用，曾利用蛭弧菌Bd-9進(jìn)行了5種保藏方法及其存活效果的觀察實(shí)驗(yàn)，其結(jié)論為冷凍干燥法保藏效果最好，21個(gè)月的復(fù)活率高達(dá)100%，其次為4℃營(yíng)養(yǎng)肉湯液保藏法和-20℃甘油保藏法，17個(gè)月復(fù)活率均為67%。2008年文獻(xiàn)[14]發(fā)現(xiàn)以1/100 NB等低營(yíng)養(yǎng)液體為保護(hù)液，瓊脂為載體，加入適量宿主菌后保存于4℃，蛭弧菌保藏可達(dá)兩年以上。而在國際上，公認(rèn)的長(zhǎng)時(shí)高效的保藏蛭弧菌菌株的方法有冷凍真空干燥法和液態(tài)氮超低溫兩種。這兩種方法雖然有效，但其操作繁瑣，成本高昂。其他一些簡(jiǎn)單易行的方法，如自來水宿主軟瓊脂保藏蛭弧菌培養(yǎng)物方法，雖然簡(jiǎn)單，但保藏時(shí)間較短且效果差[15]，不符合實(shí)驗(yàn)室教學(xué)時(shí)長(zhǎng)期使用蛭弧菌的需求。因此為了尋找一種更為簡(jiǎn)單高效并適合實(shí)驗(yàn)室教學(xué)用的保藏方法，本文采用了-80℃甘油保藏法、4℃平板保藏法和4℃甘油保藏法這三種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的蛭弧菌進(jìn)行保藏處理，并篩選出最佳保藏方法為-80℃甘油保藏法。該方法的建立不僅簡(jiǎn)單快捷，而且降低了實(shí)驗(yàn)成本，同時(shí)也為繼續(xù)開展蛭弧菌相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)菌種

本文蛭弧菌由四川大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；宿主菌為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，為本課題組保存菌種。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

宿主菌培養(yǎng)基為液體LB培養(yǎng)基。蛭弧菌培養(yǎng)基為雙層培養(yǎng)基，上層為0.4%瓊脂LB半固體培養(yǎng)基，下層為2%瓊脂培養(yǎng)基，具體配置方法見文獻(xiàn)[11]。

1.3 主要儀器及試劑

GR85DA全自動(dòng)滅菌鍋購自Zeaway，1300系列-A2生物安全柜購自美國Thermo，SHP-080生化培養(yǎng)箱購自上海精宏，Micro-17離心機(jī)購自美國Thermo。甘油由市面上購買所得，121℃滅菌20 min；生理鹽水(0.85%)121℃滅菌20 min。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備宿主菌菌懸液

勾取斜面培養(yǎng)基上的大腸桿菌菌體至液體LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，置于4℃冰箱中備用。

2.2 蛭弧菌純液的制備

取已長(zhǎng)有較大蛭弧菌單斑的雙層平板，按無菌操作要求，用火焰滅菌的接種環(huán)挑取蛭弧菌單斑浸泡于裝有1 mL滅菌生理鹽水的EP管中，搗碎混勻后10 000 g離心10 min，用無菌注射器吸取上清液，再用0.22 μm的細(xì)菌過濾器去除大腸桿菌，以獲得純的蛭弧菌菌液。

2.3 蛭弧菌的保藏方法

2.3.1 4℃平板保藏法

將稱裝有3.5 mL已加熱融化的上層半固體LB培養(yǎng)基冷卻至約50℃，依次加入0.2 mL大腸桿菌菌懸液和0.3 mL蛭弧菌菌懸液，震蕩混勻后立即傾倒于預(yù)制好的下層培養(yǎng)基上，待其凝固后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)24～120 h，觀察培養(yǎng)皿中菌斑的生長(zhǎng)情況。待長(zhǎng)出較多的蛭弧菌菌斑后用封口膜密封好皿口，將培養(yǎng)皿倒置于4℃的冰箱中保藏。

2.3.2 4℃甘油保藏法

雙層平板法培養(yǎng)蛭弧菌方法同2.3.1節(jié)。當(dāng)觀察到有大量蛭弧菌菌斑出現(xiàn)后，向其中加入10 mL已滅菌的甘油，并用封口膜將培養(yǎng)基密封好后置于4℃的冰箱中保藏。

2.3.3 -80℃甘油保藏法

蛭弧菌純液的制備方法同2.2節(jié)。將菌液與甘油以4∶1的比例加入10 mL的滅菌管中，在振蕩器上充分搖勻后，用封口膜密封管口。先將混合液置于-20℃的冰箱中預(yù)冷24 h，然后放入-80℃的冰箱中保藏。

2.4 蛭弧菌的復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)

取以上3種方法保藏的菌種定期進(jìn)行復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)，觀察保藏效果。蛭弧菌的復(fù)活方法為雙層平板培養(yǎng)法。對(duì)4℃平板法保藏的蛭弧菌來說，先將雙層平板的上層刮到滅菌的生理鹽水中，并將培養(yǎng)基盡量搗碎，然后置于37℃下放置30 min，讓更多的蛭弧菌游離出培養(yǎng)基。按2.2節(jié)方法，得到純的蛭弧菌菌懸液。再按2.3.1節(jié)方法制成蛭弧菌雙層平板，并分別在第1～第5天觀察平板上菌斑的形成情況。對(duì)于4℃甘油平板保藏法所保藏的菌種，應(yīng)先將培養(yǎng)基中的甘油倒掉后再制成菌液，再按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)于-80℃甘油保藏的菌液，待其恢復(fù)室溫后便可直接使用，按上述方法制作雙層平板以供觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)至少兩個(gè)蛭弧菌菌斑為陽性，少于兩個(gè)為陰性。

3 結(jié)果與分析

我們對(duì)三種不同方法保存的蛭弧菌定期進(jìn)行復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)菌種活性，并做統(tǒng)計(jì)。如圖1所示，3種保藏方法復(fù)蘇后的蛭弧菌均可形成噬菌斑。

(a)4℃平板保藏2個(gè)月 (b)4℃甘油保藏12個(gè)月板保藏方法時(shí)蛭弧菌可(c)-80℃甘油保藏18個(gè)月

圖1 三種保藏方法比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。從表1中可以看到，采用4℃平板保藏方法時(shí)蛭弧菌可保存1～2個(gè)月；4℃甘油保藏法可保藏11～12個(gè)月；效果最好的是-80℃甘油保藏法，連續(xù)保藏18個(gè)月后，蛭弧菌仍保持較高的活性。

表1蛭弧菌不同保藏方法的活性鑒定結(jié)果

時(shí)間/月4℃平板保藏法4℃甘油保藏法-80℃甘油保藏法1+++2+++3-++4-++5++6++7++8++9++10++11++12-+

(續(xù)表)

時(shí)間/月4℃平板保藏法4℃甘油保藏法-80℃甘油保藏法13-+14+15+16+17+18+

注：+表示蛭弧菌檢測(cè)結(jié)果為陽性；-表示蛭弧菌檢測(cè)結(jié)果為陰性

4 結(jié)束語

蛭弧菌是一類可以通過細(xì)菌濾器并寄生于多種有害細(xì)菌并導(dǎo)致其裂解的革蘭氏陰性細(xì)菌[16]，有望成為“活抗菌素”[17-18]，因此也被認(rèn)為是自然凈化的生物因子之一。基于蛭弧菌的這些獨(dú)特的生物學(xué)特性，四川大學(xué)生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心開設(shè)了一系列關(guān)于蛭弧菌的創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)——用雙層平板法培養(yǎng)蛭弧菌[10]、用平板菌落計(jì)數(shù)法驗(yàn)證蛭弧菌對(duì)污水的凈化效果[11]和用相差顯微鏡觀察蛭弧菌形態(tài)和運(yùn)動(dòng)[19]。上述創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)均獲得了較好的課堂效果和反饋，但在實(shí)際教學(xué)過程中由于蛭弧菌保存方法有限，蛭弧菌長(zhǎng)時(shí)間保藏是一個(gè)難題。因此開發(fā)一種既能長(zhǎng)期保存又成本低廉操作簡(jiǎn)單的菌種保存方法就成了當(dāng)務(wù)之急。

本文使用同一種蛭弧菌及同一種宿主菌，對(duì)蛭弧菌的3種保藏方法進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)-80℃甘油保藏法保藏時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)18個(gè)月，復(fù)蘇后不僅第一代活性較高，而且第二代和第三代活性仍然較好。該方法不僅需要的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作步驟十分簡(jiǎn)便，而且不需要頻繁接種。因此，該方法非常適合于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中使用，為本實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心繼續(xù)開設(shè)蛭弧菌相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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