肝臟疾病中外泌體的作用和臨床研究進展

楊 帆，楊 濤，王福生，徐若男

細胞和細胞之間須要通過彼此交流、發(fā)送和接受信號分子調(diào)節(jié)它們之間活動。大部分是由經(jīng)典的配體-受體相互作用介導。然而，越來越多的研究顯示胞外囊泡可能有助于配體的釋放，介導多種生物活性分子轉(zhuǎn)移到另一個細胞。這些囊泡的直徑多在10～1000 nm之間，富含蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物活性分子[1]?；谄鹪础⑽锢硇再|(zhì)和功能不同，可將囊泡分為外泌體、微粒與凋亡小體[1]。本文著重介紹外泌體。

1 外泌體的基本特性

外泌體于1983年首次在綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，由于其來自于細胞內(nèi)吞系統(tǒng)，被當做是細胞丟棄的“垃圾”，一直未被重視。隨著科學的進步，學者們發(fā)現(xiàn)外泌體實際上是一種特異性的亞細胞結(jié)構(gòu)，并不是簡單的細胞碎片。外泌體在電鏡下呈球狀、杯狀或扁足球狀，直徑在30～100 nm之間。它主要由細胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成，經(jīng)過多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中。幾乎所有的外泌體都富含有四跨膜蛋白家族（例如CD81、CD63和CD9等）、微管蛋白等，在細胞滲透、入侵和融合中發(fā)揮重要作用。但是，不同細胞來源的外泌體在蛋白組成上也存在一定差異，例如B細胞來源的外泌體含有CD86和MHC類分子；T細胞來源的外泌體表面有FasL表達。除了脂質(zhì)和蛋白質(zhì)外，外泌體中還包含有mRNA、微小RNA（microRNA, miRNA）、轉(zhuǎn)錄RNA、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, LncRNA）和病毒RNA等[3]。這些不同類型的RNA，可以影響受體細胞的轉(zhuǎn)錄。例如，在體外實驗中，將小鼠mRNA通過外泌體轉(zhuǎn)移到人類肥大細胞，導致在受體細胞中產(chǎn)生新的小鼠蛋白[4]。來自心祖細胞的外泌體可通過遞送miRNA-21（miR-21）來預防心肌細胞凋亡[5]。來自CD90+肝癌細胞的含有H19 LncRNA的外泌體可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的表型[6]。

外泌體的首要功能是進行細胞間通訊，在相鄰細胞和遠處細胞之間轉(zhuǎn)運各種信號分子。外泌體的膜蛋白可直接或通過內(nèi)吞作用融合到質(zhì)膜中，將其攜帶的載體遞送到受體細胞的細胞質(zhì)中。外泌體在大小和內(nèi)容物上的表現(xiàn)是不盡相同的，并表現(xiàn)出不同的生物效應和靶向特異性。作為信號復合物，外泌體將攜帶的信號分子由一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞，從而將特異性mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到受體細胞的細胞質(zhì)中。

外泌體可由幾乎所有類型的細胞分泌，而且分布于包括血液、膽汁、腹水、唾液、腦脊液、尿液、羊水和精液等在內(nèi)的體液中[7]。對于各種途徑來源的外泌體而言，分離外泌體是一個至關(guān)重要的挑戰(zhàn)。超高速離心是分離外泌體最經(jīng)典的方法[8]。這種方法可以產(chǎn)生高純度的外泌體，但是消耗的時間較長。超過濾離心法是分離外泌體的另外一種方法，其原理是基于囊泡的大小，通過微過濾器除去直徑較大的囊泡群體[9]?，F(xiàn)在也可以使用ExoQuick試劑盒來分離高純度的外泌體。

2 外泌體在肝臟疾病中的作用

2.1 外泌體與病毒性肝炎的關(guān)系 肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展經(jīng)歷了典型的三個過程：慢性肝炎、肝纖維化和肝硬化、肝癌。近期研究顯示，外泌體可能參與了肝臟疾病的發(fā)病過程。

外泌體在細胞間的通訊作用使其在病毒感染期間能夠發(fā)揮抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。從HCV感染者血清分離出的外泌體中包含有HCV RNA、Ago2和熱休克蛋白90等分子。這些HCV相關(guān)分子借助外泌體傳播到未感染的肝細胞并建立感染。與HCV感染的過程相一致，從慢性乙型肝炎患者血清中分離的外泌體也可以檢測到HBV的核酸和蛋白，由此表明借助外泌體可完成病毒在肝細胞間轉(zhuǎn)移。此外，外泌體中含有的HBV核酸可以通過抑制RIG-1表達和下游信號通路而抑制NK細胞的殺傷功能[10]。

相反，外泌體同時還具有抑制HBV和HCV感染的作用。研究發(fā)現(xiàn)包含有外泌體的HCV RNA可以誘導漿細胞樣樹突狀細胞分泌IFN-α[11]，通過抑制病毒的生命周期抑制病毒傳播。IFN-α誘導肝竇內(nèi)皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells, LSECs）分泌抗病毒外泌體，抑制HCV的復制[12]。同樣，IFN-α誘導的抗病毒反應可以通過外泌體由肝臟非實質(zhì)細胞傳播到HBV感染的肝細胞上，從而發(fā)揮抗病毒功能[13]。以上結(jié)果表明，病毒感染和抗病毒反應是通過外泌體介導的細胞間通訊來實現(xiàn)的。

2.2 外泌體參與肝組織損傷和肝纖維化的進程 肝損傷多數(shù)因直接毒性、局部缺血或代謝紊亂而引起。外泌體作為細胞間通訊的載體介質(zhì)，可能有助于促進局部環(huán)境對細胞或組織損傷的反應，并參與組織的修復或重建。研究發(fā)現(xiàn)肝細胞釋放的外泌體可以介導藥物性肝損傷期間的早期免疫應答[14]。間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可誘導肝細胞增殖從而減弱CCL4誘導的肝損傷，并且在對乙酰氨基酚或過氧化氫誘導肝損傷模型中同樣具有促進細胞增殖功能[15]。此外，肝細胞來源的外泌體在體內(nèi)肝切除術(shù)和缺血/再灌注損傷后也可以顯著促進肝細胞增殖。其機制與外泌體轉(zhuǎn)運神經(jīng)酰胺和SK2到靶細胞密切相關(guān)。因此，具有增殖活性的外泌體可以逆轉(zhuǎn)各種原因引起的肝損傷，并且可能是肝損傷的新型治療方法[16]。

肝損傷過程多伴隨炎癥反應，后者是肝纖維化和肝硬化的主要原因。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF-2）是一種在各種纖維化中起作用的多功能肝素結(jié)合糖蛋白。在肝纖維化中，CTGF-2在激活的肝星狀細胞（hepatic stellate cell,HSC）中表達明顯升高，并且直接調(diào)節(jié)HSC功能[17]。在小鼠模型的實驗中研究發(fā)現(xiàn)，CTGF-2廣泛存在于激活的HSC來源的外泌體中[18]。miR-214是一種與纖維化相關(guān)的miRNA，外泌體可以攜帶miR-214到相鄰細胞直接調(diào)節(jié)CTGF-2的表達。

Witek等[19]研究發(fā)現(xiàn)，HSC和膽管細胞可以將含有Hedgehog配體的外泌體釋放到LSECs中，導致肝硬化期間LSECs的功能障礙。此外，來源于原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis, PBC）患者血清中的外泌體可以在不同的抗原呈遞細胞中選擇性的誘導共刺激分子的表達[20]。這種改變與PBC以及其他自身免疫性肝病的發(fā)病機制相關(guān)。

2.3 外泌體與肝腫瘤細胞間的相互作用 在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，外泌體的作用同樣不可忽視。外泌體借助自分泌或旁分泌形式作用于靶細胞從而發(fā)揮其生物學效應，其作用機制包括：①調(diào)控細胞增殖，通過腫瘤細胞的遷移和侵襲等行為促進肝細胞癌（hepatic celluler cancer, HCC）的進展[21]；②通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境促進HCC的進展。HCC細胞來源的外泌體包含多種調(diào)節(jié)TAK1的表達和信號傳導的miRNA，以促進HCC的發(fā)生和發(fā)展。此外，HCC來源的外泌體通過誘導肝細胞分泌MMP-2和MMP-9促進HCC細胞侵襲。針對外泌體的這些功能可以更好的抑制HCC的進展。相反，外泌體在抗腫瘤方面也發(fā)揮著重要的作用。在HCC小鼠模型中，脂肪來源的間充質(zhì)干細胞的外泌體可以顯著地抑制HCC的發(fā)展。主要機制與外泌體增強宿主NK細胞的殺傷功能密切相關(guān)。

2.4 外泌體在酒精性和非酒精性脂肪肝中的作用 隨著生活水平的不斷提高，酒精性脂肪肝的發(fā)生比例逐年升高。除傳統(tǒng)的免疫細胞、炎性因子外，來源于外泌體中的各類蛋白質(zhì)分子及miRNA分子也是參與酒精性脂肪肝發(fā)生和發(fā)展的重要因素。例如：①對乙醇誘導酒精性肝炎小鼠模型研究顯示，血液中miR-192升高可能是酒精性肝損傷加重的危險因素之一[22]；②乙醇暴露單核細胞釋放的外泌體可刺激幼稚單核細胞的極化，使之分化成具有促炎癥作用的M2型巨噬細胞；③乙醇處理的單核細胞外泌體中富含miR-27a，可以正反饋性活化和極化其他單核細胞[23-24]。此外，乙醇可加速肝細胞來源外泌體中的效應分子miR-122向單核細胞轉(zhuǎn)運，這種轉(zhuǎn)運方式對于增加脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）敏感性相關(guān)的酒精性炎癥至關(guān)重要[25]。

來自內(nèi)臟脂肪組織（visceral adipose tissue,VAT）的外泌體也可以通過誘導肝細胞和HSC中TGF-β途徑參與非酒精性脂肪肝的進展。因此，VAT來源的外泌體為非酒精性脂肪肝的病理機制提供了新的見解。

3 肝臟外泌體作為診斷和預后的生物標志物

多數(shù)肝臟疾病因早期階段沒有顯著癥狀，常至晚期階段（5～50年）才被發(fā)現(xiàn)，常規(guī)的影像學檢查和實驗室檢查對于疾病的早期診斷具有一定意義。侵入性肝活檢仍然是診斷的金標準。因此，開發(fā)新穎、可靠和無創(chuàng)的診斷方法一直是科學家努力的重大方向。目前，來自尿液和血液的外泌體被認為是非侵入性（尿液）和微創(chuàng)（血液）分子生物標志物來源，可用于各種疾病的早期檢測和預后。這種方法基于觀察血液或尿液外泌體中所含有特異性蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等。例如：①miR-122是肝臟疾病中最常見的miRNA。它是肝臟中的主要miRNA，發(fā)生HCC時外泌體中的miR-122表達降低[26]。在體外，miR-122可以抑制腫瘤生長，敲除miR-122后抑制腫瘤細胞凋亡，上調(diào)HCC細胞活力，這提示其可能是通過外泌體的相互通訊作用抑制腫瘤增殖和遷移，因此miR-122可能是HCC的良好治療或診斷靶點[27]。而在長期酒精喂養(yǎng)的小鼠模型中，升高的血清miR-122水平與肝損傷相關(guān)[28]。飲酒會引起腸道細菌通透性和內(nèi)毒素（也稱為LPS）升高。暴露于酒精的肝細胞分泌含有升高miR-122的外泌體，這些外泌體被巨噬細胞吸收并使其對LPS致敏，在體外導致細胞因子分泌增強[29]。②miR-21是肝臟疾病研究中另一外源生物標志物。之前的研究表明miR-21可能與miR-122具有相反的功能。與健康個體相比，HCC患者的血清和血清外泌體中的miR-122的表達降低，敲除miR-122可以抑制腫瘤細胞凋亡并增加HCC細胞的活力；與之相反的是，miR-21在HCC患者的血清和血清外泌體中表達升高，通過敲除miR-21可以增強細胞的凋亡并降低HCC細胞的活力[30]。這些研究表明miR-21可能是肝臟病理學中另一個強大的生物標志物。③研究表明miR-192通過靶向涉及不同類型的癌基因抑制體內(nèi)和體外HCC細胞的轉(zhuǎn)移。此外，miR-155是與炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNA之一，其表達水平在慢性HCV感染患者的血清和外周單核細胞中升高[31]。另一項對miR-155敲除小鼠的研究已經(jīng)證明，miR-155的缺乏可減輕肝臟脂肪變性和纖維化，但不能減少由甲硫氨酸-膽堿缺乏引起的肝損傷和炎癥[32]。這些早期的研究表明，一些miRNA可能有助于了解肝臟疾病的機制并在診斷和治療中可能成為肝臟疾病診斷的新型生物標志物（表1）。

表1 外泌體的生物學診斷標志物Table 1 Biological markers of exosomes

4 外泌體在肝臟疾病治療中的應用

外泌體因生物學效應十分廣泛，可以調(diào)控腫瘤細胞，參與病毒的復制和傳播，同時，還可以促進細胞再生，對于維持機體平衡發(fā)揮了重要的作用。來源于實質(zhì)或非實質(zhì)細胞、免疫和非免疫細胞的外泌體都可能成為治療多種肝臟疾病的重要手段。尤其是隨著干細胞臨床應用的進一步拓展，間充質(zhì)干細胞來源的外泌體治療肝臟疾病也突顯出良好的優(yōu)勢和應用前景。

將人間充質(zhì)干細胞來源外泌體注射到小鼠肝臟中，通過抑制體內(nèi)膠原和TGF-β1的表達，可以緩解CCL4誘導的肝纖維化進展[40]。另有研究表明，絨毛膜-間充質(zhì)干細胞來源的外泌體釋放富含有miR-125b的外泌體可以介導和靶細胞（例如HSC）之間的miR-125b轉(zhuǎn)移，從而緩解CCl4誘導的肝纖維化。脂肪間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可將miR-122轉(zhuǎn)移到HSC中并調(diào)節(jié)HSC的增殖。這些數(shù)據(jù)表明可以通過外泌體介導的miR-122遞送可改善脂肪間充質(zhì)干細胞的治療效果，有望成為治療肝纖維化的新策略。因此，間充質(zhì)干細胞來源外泌體可以緩解肝纖維化。

此外，間充質(zhì)干細胞在肝癌細胞生長和增殖中發(fā)揮重要作用。體內(nèi)和體外實驗證實，來源于間充質(zhì)干細胞的外泌體通過遞送選擇性蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA到HCC細胞中抑制腫瘤細胞的生長和增殖。①脂肪間充質(zhì)干細胞來源的外泌體通過增加腫瘤內(nèi)和循環(huán)NKT細胞抑制HCC細胞的生長。②體外實驗中，骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體抑制細胞周期進程并誘導HepG2細胞凋亡。③使用抗癌藥物治療后，HCC細胞將富含有熱休克蛋白的外泌體遞送到NK細胞，以增強其抗腫瘤活性[41]。因此，外泌體在肝癌治療中具有抗腫瘤作用。當然，除了間充質(zhì)干細胞來源的外泌體對肝癌的進展有一定的作用之外，肝細胞來源的外泌體可以誘導產(chǎn)生鞘氨醇-1-磷酸酯，導致肝細胞再生和缺血/再灌注損傷后的肝組織修復。內(nèi)皮細胞來源的外泌體可以通過鞘氨醇-1-磷酸調(diào)節(jié)HSC信號傳導和遷移[42]。這些研究表明，外泌體及其組分參與肝細胞再生和遷移過程，因此可能是肝臟疾病和損傷的潛在治療工具（圖1）。

圖1 間充質(zhì)干細胞來源的外泌體在肝臟疾病的作用Figure 1 Role of mesenchymal stem cell-derived exosomes in liver disease

除外泌體對于疾病的直接治療效應以外，外泌體也可以載體的形式將富含的特異性生物分子遞送至靶細胞發(fā)揮其生物學效應。另外，外泌體還可以作為疾病發(fā)生和發(fā)展的分子生物學標志物用來監(jiān)測疾病治療的功效。但是因為外泌體的非特異性，可能是影響其發(fā)揮其生物學特異性的瓶頸。

5 展 望

外泌體是細胞之間進行生命活性物質(zhì)交換的重要載體。外泌體在肝臟炎癥性和非炎癥性、肝硬化和肝癌中發(fā)揮重要作用。與傳統(tǒng)病理學和實驗室診斷方式相比，外泌體可能是肝臟疾病診斷的另一種可靠標志物。事實上，miRNA對各種肝臟疾病具有良好的敏感性和特異性。然而，目前在利用miRNA的診斷肝臟疾病上存在一定的限制。首先，外泌體的選擇缺乏統(tǒng)一標準：在不同的實驗條件下，外泌體及其蛋白分泌的水平是隨環(huán)境的變化而變化的，因此，進一步量化標準，增加實驗的可靠性及可重復性是迫切須要解決的問題。其次，基于外泌體的脂膜通透性，使其作為生物載體的應用越來越廣泛，但是其穩(wěn)定性和安全性是我們要重點關(guān)注的內(nèi)容。另一方面，關(guān)于外泌體的生物發(fā)生，攝取和細胞功能的認知依然不足。與任何新興領(lǐng)域一樣，有許多問題亟待解決，并存在若干挑戰(zhàn)，仍須要我們進行不斷地探索。

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